质粒提取的常见问题，我总结了最基本的，欢迎大家跟贴，多多交流！

1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS： SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把 pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA 溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？
在pH 为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？
加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa= 9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4) 2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的 EDTA更能稳定DNA的活性。

8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？
采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。

9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份 24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为 DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为 0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。


以上资料源自丁香园（freecall），感谢！

我们以前也用酚氯仿，现在都用试剂盒了，建议使用试剂盒代替传统的分氯仿＋碱裂解法，效果还是好很多而且节省时间。另外，快速提取也可以用异丙醇质粒沉淀方法，少了酚氯仿抽提，节省时间而且可以减少接触酚的机会，效果差一些，但可用于酶切。

1、 取菌液至1.5mL离心管中，12000 rpm离心30秒，弃上清并重复该步骤共离心3ml菌液；
2、 加入100ul溶液I，振荡器上充分悬浮菌液；
3、 加入200ul溶液II，上下轻柔颠倒5次左右，直至菌液澄清；
4、 加入150ul溶液III，上下轻柔颠倒5次左右，直至白色絮状沉淀聚集成团；（-20度静置2-3分钟更佳）；
5、 12000rpm离心5min（10min更佳），将上清用移液器转移至新的灭菌后离心管中；
6、 加600ul异丙醇上下轻柔混匀，室温静置5min；
7、 12000rpm离心10min，去掉上清后在卷纸上扣干，放在质粒干燥器上干燥；
8、 60ulTE融解质粒后保存。

异丙醇沉淀法提取质粒，成本低，操作也简单，虽然用于酶切后连接的正确率不如试剂盒提取的，但大家在需要同时帮助多个酷友提供共享时，可以考虑采用这个方法提质粒。收到的酷友拿来转化的效率不受影响。

     

以下是基因酷现在的提质粒方法：

方法采用快速提取法（异丙醇沉淀法），溶解的体积为100ul。注意：使用TE。

效果评价：跑胶观察提取的量。

溶液I：葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH8.0。

溶液II：NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。

溶液Ⅲ：取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸11.5mL，混合后加ddH2O至100mL。

⑴从平板上挑取单菌落，接种于3mL LB液体培养基中（加有相应的抗生素），37℃振荡培养至OD600 2.0以上，但也无需过浓。菌液收集于1.5mLEppendorf管中，12000rpm离心15～30sec，弃上清。通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干；

⑵加入100uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分悬浮；

⑶加入200uL溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解；

⑷加入150uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈；

⑸置冰浴10分钟，也可置于-20℃中5min；

⑹12000rpm离心5分钟，上清吸到另外一个离心管，再12000rpm离心5分钟；

⑺上清吸到一个加有400uL异丙醇的离心管中，室温放置5分钟；

⑻13000rpm离心10分钟；

⑼迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干；

⑽置于恒温器上干燥(55℃)至无色透明或无乙醇气味，一般大约5～10min；

⑾加入100uL 1×TE缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用。

比较简单哦， 跟师兄做大抽质粒一个月，抽得人都 晕了。 最搞笑的是最后一次，遇到百年难得一见的事： 第一是摇菌的时候由于我没有放好，4瓶200ml菌液有2瓶活生生的不见了。汗啊！（还好师兄没怪我！） 第二是：2瓶也抽，从中午做到晚上，大约8点多了，用酚氯仿抽提的时候，有一个离心管居然离爆了，看到师兄惊讶的表情， 我真的很无语啊！ 哎……

这个是从生物谷转的，但来源是复旦大学生化与分子生物学实验室