大家好，我有个问题请教大家．
通过测序得到一个新的ＯＲＦ，如何知道它的功能．给出实验方案．

[ 本帖最后由 纤夫 于 08-2-23 13:23 编辑 ]

基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout), 从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究, 综合分析.

biobowl 的帖子很精辟，可以理解为“对某个新基因进行功能研究的技术路线”。希望大家针对这个主题多多交流。

To 楼主：
为了更好的讨论，已经将主题进行修改，呵呵。

非常感谢呀．

但真设计实验的话我又不知道如何入手了呀.

谢谢.请大家讨论.

biobowl酷友说的相当精彩，其实涉及到具体实验还是比较容易设计，比如关于基因在转录水平的调控以及体内基因的分布，这个是了解该基因功能的一个比较直观的方面，你可以采用半定量或者实时定量的方法来进行，半定量可以采用不同组织RNA抽提后反转录cDNA 然后进行半定量表达分析，可以加入B-actin等内参进行控制，同样有条件可以使用定量PCR进行mRNA表达分析。同时对于表达蛋白的研究可以采用免疫组化的实验，总之这个是一个很大的课题，呵呵你一个人应该做不完的哦，祝实验顺利
！！！！！

是呀, .实验总是耗费时间.

关于基因的表达和定位，可以这样去做：

1. mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或real time RT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northern blot、Rnase protection assay方法，检测基因的mRNA表达情况/变化。）

2. 蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。

3. 检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。

非常好的贴子，我正为下一步研究基因的功能而愁呢