使用一抗和二抗（辣根过氧化物酶）都抗完了后要去暴光，加发光液一般以多长时间为宜啊？

我使用发光液处理１分钟，暴完第一张后第二张就开始缺口了

处理２分钟暴到第三张也不行了．

但是我同学做的话处理１分钟就可以暴十几张出来（细胞内源蛋白）？

是因为我的是转染得到的蛋白，蛋白表达量少吗？？
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再做曝光时发现底片上几乎什么都显现不出来，如下图所示。只有最上面和最下面出现点条带，但是确不是我需要的条带，什么原因？一抗和二抗没有抗好吗？我已经两次都出现这种结果了。。。

这次二抗加了多一点，二抗稍微多一点会出现这种明显的无法暴出图像的情况吗？

PS 图片是用手机照的

[ 本帖最后由 aki 于 07-9-13 08:43 编辑 ]

1. 楼主指的是做Western blot时加入的化学发光液吧？加发光液需要多长时间，这要看具体的试剂的要求，你可以看看你买的发光液的说明书 ，那里应该有说明的。我用过Pierce的Super Signal West Pico, 它的要求是5min左右；而Phamacia（现在叫GE）公司的ECL kit要求是1min左右。

2. 你所言“暴完第一张后第二张就开始缺口了”，可能不是蛋白表达量少的问题，而可能相反，是表达量较多所致（加之你检测的是转染后表达的蛋白）。这样的表现是因为蛋白表达量高，所以结合的一抗和二抗也多，所以化学发光发应进行的太快，导致发光反应结束得较早。
    建议适当减少蛋白上样量，或适当减低一抗和二抗的浓度，试试看。

祝好运

谢谢纤夫，回头我多试试去嘻嘻:D

RT

又出现新问题了

这次再抗的时候少添加了二抗的量多爆出了几张图片

再抗别的抗体的时候多添加了点二抗结果就出现了上面贴图的结果

找不出到底是什么原因。。。

二抗稍微多加了点真的会使得曝光无爱抚完成吗i，上图是我暴的第一张，结果就是出不来条带

是不是还有其他什么原因存在呢？