我在做基因克隆,开始是以CDNA为模板,可是RNA容易降解,CDNA 也不怎么稳定,想考虑下用DNA为模板可以么?好像DNA包含外显子和内含子,而CDNA直接就是编码区了,是否有可能扩出来的是内含子区域?如果仅仅做基因克隆,用DNA扩出来是否可以送去测序啊?(我是用的兼并引物,以氨基酸保守序列设计的引物)
以DNA和CDNA分别为模板克隆基因,结果有什么区别么?

真核生物 genomic DNA 和cDNA的差异主要是在lz说的内含子外显子的区别，另外还有一个就是水平问题。
如果把genomic和cDNA都当作一个库, 那么genomic DNA库是相对不变的，每个基因的拷贝数都是固定的，你可以从脑细胞的基因组中调到肝特异表达的基因，也可以从衰老的组织上调出胚胎期表达的基因；然而cDNA库是一个动态库，它随时（发育期、细胞周期）空(不同组织、细胞）而变。
但是cDNA库调出来的都是直接的转录产物，而转录产物在genomic上是被内含子打断的，打断的部分有可能间隔很远（几K，几十k）。
如果你是根据表达产物设计的简并引物，在genomic DNA为模板的体系扩增，可能出现的情况有：
1、引物结合区没有被内含子打断，外显子相隔不远，有产物；
2、引物结合区被内含子打断，无产物；
3、引物去和区没有被内含子打断，但外显子相隔太远，无产物。
因此，推荐还是以cDNA为模板，减少后期工作量，至于RNA实验的难度，作过了也就不算什么了。只是以cDNA为模板要注意选取的组织或细胞上目的基因的表达水平。

实在太谢谢了 我还想问一下,怎么样检验cDNA的质量呢?
有一管CDNA放在--20度很久了,用起来不大放心,怎么样检测它的质量呢/

-20度存放，贮存液为TE的话，半年应该不会对结果有太大影响。

如果担心，可以测定一下260/280和260/230看看有没有降解。

不同意楼上的意见，OD比只是看是否有其他大分子的污染，检查是否降解的效果是不显著的。比如我们提完RNA，是通过OD比检查是否污染蛋白和DNA，但是完整性还是要看电泳带形来判断。
检查cDNA的完整性是一个比较棘手的问题，我也在其他论坛上见过类似讨论，但都没给出一个完美的答案。有人说通过扩增内参来检测，但内参一般是高丰度的东东，所以不能反应一些低丰度片段的完整性。
我认为TE溶解确实能延长保存期，另外可以通过分装多管来减少反复冻融的次数来保证一次逆转录产物的完整性。反正如果你之前可以扩出来的片段扩不出来了，就重新拿一管或者干脆重提RNA就好了。

学习学习

学习了啊

见解很深，值得学习

可是我们导师让我们用DNA做，郁闷呀，做不出结果怎么办？

高手过招！好看！