细胞培养常见问题分析
# u, _2 a: ?+ \( L: y* o( B1. 冷冻管应如何解冻？
) P( N6 q" N: a" J3 ` 取出冷冻管后， 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
4 Y p y( L, ~2. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？) s0 ~1 R. X4 `+ r: f1 b( y
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
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3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 1 o. g( g( F9 k$ L- d- S9 \
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。
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4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
3 N0 U( Q8 o5 ~ M8 H 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
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5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ? 0 Z+ S1 r; f" O4 e3 t
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
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6. 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ ( i2 {: r. i. h/ L) I Y& D$ W
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。
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7. 何时须更换培养基？ - F$ ]7 r6 ^) {: Z2 H5 e% |
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
4 n; d5 o4 R P* j' h/ p( x# Q8. 培养基中是否须添加抗生素？
; w- K- O O1 j; `+ h, `" U 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
$ y9 h5 D# M9 `. L9. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 3 D4 r0 C9 j" s
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于–20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
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10. 悬浮性细胞应如何继代处理？: J0 m4 r2 T! A5 p/ A6 W3 _
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
& b8 ]) `+ I( [& N) W% J11. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
5 R8 j( L5 V( ]" |, C 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。
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12. 细胞之接种密度为何？ 4 w! X* h3 f+ K3 y2 B
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
0 W6 |# g t t g4 T6 A13. 细胞冷冻培养基之成份为何？
0 _+ K2 M7 H9 ^, U( I0 C) S 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
% ~& d( Y) v' a5 c3 `# U# V0 R14. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ . ]2 w' A4 n7 m6 H. C0 y& m
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
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15. 冷冻保存细胞之方法？
& c; E8 s& R4 _" ^/ y3 _- u, T 冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
% s! G' R$ ]4 O$ ^ 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
4 E+ ~( T( ], ]4 d5 q' f16. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？6 F/ \ k; W. S0 i G) |. N
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
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17. 应如何避免细胞污染？
5 u/ v. S( }* ?8 i9 C 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
1 J! l6 h1 z8 V3 e18. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
& v- Y6 N% F# a7 [$ s 加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。
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19. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
: _! K6 s8 h1 S 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
3 G9 P) r7 d( I20. 支原体污染会对细胞培养有何影响？
0 _7 n" Z& i$ r, Z" _: ^7 b z. M 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
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21. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
, T6 A7 w8 Y% ~1 M4 A 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
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22. 为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？
/ j7 \4 b, @4 ~* {8 ], A) h 培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。
" X$ f( [' n/ [8 R23. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
v9 t4 s, m# |6 z/ u7 E5 c 不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
. T: x( C: q3 H24. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
$ ^2 E& C8 Q, z 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
3 d6 G$ D8 Z. {+ o* `7 J* }25. 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 6 h4 a3 m# m, \6 N: a& q+ r
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。
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26. 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？% J2 q: m5 L0 v" M+ C `4 D$ {
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。
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27. 如何选用特殊细胞系培养基？
4 N+ c, J! r0 F3 f4 P4 K 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。
& p, ~, c! q+ Y+ B* ~# U; b28. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ # y( ]" K H5 \8 g' D5 C! [
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
: B0 P% y4 h& \! P29. GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
$ Z+ m1 q0 r6 J% y. j6 ^ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
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30. 什么培养基中可以省去加酚红？
2 N9 A6 H+ }/ g8 e9 V; v4 r" } 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
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31. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
5 y+ M: h7 {& b+ F 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
3 U; h* @9 m8 r E( q32. 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
5 I n" g0 c+ Q8 W! t( @3 i 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
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33. 书上说，Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？) r0 R+ K* {( l& Z. O3 ?7 e+ M1 n4 q
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
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血清
/ P. B, B2 y p+ ~( [34. 保存血清最好的方法?
4 @6 h5 V+ u! h6 L4 R8 K* _ 建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
) f q, s! r3 S8 j35. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?
$ l! D; o% P; J( w. i2 r% M 建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
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36. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
4 ], W3 ]! w$ d" M' \8 k/ g/ S 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
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37. 为什么要热灭活血清?/ L, D0 I) d2 Q/ C" H& `* S c
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
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38. 有必要做热灭活吗?5 C: G" N ]& c! e- P& K
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
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39. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
4 s6 c, E) r5 V" z! E. g. M GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
! |8 r4 R5 g; i' Y! p" [ }/ z' b40. 如何避免血清里沉淀物的产生?
0 Y: H$ m& X0 |; c: j( [' i8 z 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。
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? 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。
, o; T, n5 S2 r! t9 Y 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
