等电聚焦凝胶电泳

& V, J: Y8 P3 z6 M
主要内容：
/ l/ y: {9 B7 X* N1．等电聚焦凝胶电泳原理" }/ A6 q2 _% K. ?6 I' v
2．等电聚焦载体两性电解质的选择7 c8 ?2 t# u' w. t1 E# n+ t+ g- z
3．等电聚焦电泳% [/ N/ P* H4 v* J! g. i
4．天然等电聚焦电泳的修正方案
& d2 s; s  M- o5．等电聚焦注意事项' u; i4 L! V( W5 [
6．固相pH梯度等电聚焦简介
. X4 h( i/ v7 Z5 B  q7．固相PH梯度等电聚焦电泳/ P  p! `# @. Y- P
8．固相pH梯度等电聚焦分析讨论
5 c) ]+ Z! G% Y3 `7 M( ^* }' }8 Z9 I/ T$ }
声明：, B6 p9 Y+ N9 i3 f5 m
1、 本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email genecool@126.com告知。" @5 p, ~) T8 w+ J9 ?* K9 P
2、 由于我们的学识、经验有限，本篇难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（www.genecool.com/bbs）本篇对应的专题跟贴指出或Email genecool@126.com。
) _1 L# C" U2 a致谢：2 |' E7 A! L6 p' C9 A/ w( |
整理者：phyllis  审改者：db  nano  
+ E5 F1 g- P/ w2 V( J# j主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》+ l5 Y) V' }5 V
. g7 z2 o) N# ~

等电聚焦凝胶电泳原理

( C/ a" i/ _( x$ U/ W: I
　　等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。; n- N' F2 X2 b( n
        等电聚焦中，只有在凝胶两端给以高电压时，才能获得较好的蛋白质条带分辨率，这就需要非常有效的凝胶冷却系统（否则会导致烧胶），即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高，并可方便的同时比较多种蛋白质样品，所以平板胶用在等电聚焦上的居多。
9 [  x$ ]- K+ Q9 M* C) [! Z        由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，若要好的重复性，制备蛋白样品时一定要小心，要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外，蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质－蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能，等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。! t/ o) |  F8 g9 p
       等电聚焦的缺点电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。
; N' }. G0 {1 c3 q. h( _* k' Y: j* t$ m- c' r4 x3 d
[ 本帖最后由 phyllis03 于 07-8-14 13:25 编辑 ]

等电聚焦载体两性电解质的选择

4 s* e- c" o  d载体两性电解质必备的条件：
/ k1 ?/ y! B# G1. 可溶性要好，为了保证等电聚焦过程中PH梯度的形成和蛋白样品的迁移，载体两性电解质必须具有很好的溶解性能。  u( \+ T7 q2 O% e5 J2 C, m% O
2. 紫外吸收低，不发荧光。由于制备分离时，检测蛋白质的方法通常是测量280cm的吸光度，因此要求载体两性电解质在280cm的吸光度尽可能低。5 [: I# B, i4 r6 p2 G
3. 在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。4 X  w9 j% X4 o
4. 在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。! T/ K: s4 Z+ t. N
5. 分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。! [; G9 G( t. q+ }) S+ [2 i
6. 化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。. Q& {0 V' K4 |# v/ b. i, X) l
7. 无毒、无生物学效应。载体两性电解质对哺乳动物的组织培养，酶活性测定，免疫检测或注射到小白鼠或大鼠中都没有影响。
1 X! v1 c2 T. b8 Y' S8. 应不与分离物质反应或使之变性。总起来说，当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这 就是好的载体两性电解质。# s7 ~" P; z& A
载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物，下面时配置不同pH范围等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方：& Z0 K! b+ x, B, c( h

pH范围 $ n& M+ ?$ `& ~; C# [* T* m	载体两性电解质pH范围' q8 d; H: W! h	凝胶中的百分比％  K+ a9 f- J. l9 g
3.5-10. x4 P! V6 h; A	3.5-10% r4 q4 s( t+ H( n: K	2.49 `& p  h6 s$ ?) u) Y
4-6, _1 Z4 _) N( q: n	3.5-10" T. G9 }8 C% \( V+ ? 4-6( R& g" @+ a2 y4 v) z1 z3 b	0.4# u1 B5 n( |7 ^1 Z+ [! } 2 * T+ U/ W0 U, }: O* L
6-9 " ?, Z7 V1 l9 T! ~8 R8 e	3.5-10 5 n! y7 `8 }* y. [% h8 v& r0 G6-8/ K) o( L7 `( q# ?7 `3 q 7-9! y* O" X# p$ r* f) \, V; \	0.4$ a+ u8 m% V2 ?& @, {( ~ 18 s7 g+ Z, X/ k 1$ `+ e5 D6 Q1 x2 Y) A# T) w7 i
9-11& J: ?( h/ n( K: C  q+ f	3.5-10 ) G- k/ g7 u+ S8 `# Q! \9 p9 g9-11# k; I# q& E+ v, a	0.4# a; s/ G+ x* p4 h, f 2' `+ p3 y8 Q% [/ ]8 ]* K% d/ D+ h

等电聚焦电泳

& X5 |) a. b* ~" x2 ]
主要仪器试剂6 U# b( g# _+ l: v3 x% F
仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器& H0 c  z1 d9 d! ^$ b& G1 i  O
试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
9 h+ F  S6 w7 X. b5 _8 Z　　储存液：1）30％（w/v）丙稀酰胺，1％（w/v）双－丙稀酰胺；2）20％Triton X100；3）10％三氯乙酸；4）1％三氯乙酸；5）1％溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；, u- }1 L" y1 t; \, L8 v5 D
灌胶
4 @$ d  D  J$ _/ B2 f. v: j& x   以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。; t% D" i1 u. `; r6 C& n0 C
水：5.4ml；  储存液1）：2.0 ml；   载体两性电解质溶液pH3.5-10  48ul； 载体两性电解质溶液pH4-6  240ul； 超纯尿素   6.0 g ；10％过硫酸胺25ul； TEMED：20ul1 h$ Y; Z: p  a8 J2 e- `
灌胶步骤：
' O* R$ e0 h4 G0 J1. 组装灌胶器；6 X' Q4 [0 W- t7 c
2. 将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；1 l8 t" ~4 j6 y0 m9 Z* H6 W
3. 加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；# x8 [$ \$ ~. Z2 F- y% w
4. 将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；' @* N3 x/ Q1 k) K% E, l
5. 插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；
) X/ |. j5 ?0 s6. 聚合约1小时；
  R! Q5 v2 l# V- f/ i7. 聚合完成，小心拔去梳子；
( k' S3 [. A& Z  J+ Z! H8. 将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。$ g' l" G" y! E* `  a! {
   注意：/ X$ T& M  w) |8 n7 F: X
1. 上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；1 n8 U2 H# P, c& K3 \
2. 现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
- j3 ^* ], i, s样品制备和上样3 O, n" {. d' w: V( W1 K, c! ~  |
　　一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15ul。
3 B* u% b# A  i2 W$ L　　变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20ul；3）pH4-6载体两性电解质：100ul；4）20％Triton X－100：500ul：5）2－巯基乙醇：50ul；双蒸水：1.7ml；1％溴酚蓝：200ul
- J" `* p' r4 d电泳：
. [) {! E9 e! F' @+ n　　操作步骤：
, `4 z2 d9 F6 u5 |* P1. 将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；
1 z* c: v5 X" r9 r$ P8 f) }, a2. 用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10ug单一蛋白组分是较合理的上样浓度。5 G" U1 `- {& E. O8 I
   电泳液：8 }2 C8 h! {" x; G* E
1. 上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；
9 O2 N0 l. O* U% q* W2. 下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。% o0 c) i; F# }3 k
等电聚焦电泳条件：
9 Z- T$ O5 f0 \5 H$ j) u1. 接好电极；
9 U% v* B. r% ^% j3 q! a" `2. 恒压150V电泳30min；8 s' i2 `0 F3 ]* s1 c$ Q
3. 恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。( N  n) R  G6 \; g. C; a. x, @. w
电泳聚焦后处理：
; b/ d6 v0 j% C   测定pH梯度：
7 [- D2 f; C+ D% G1. 将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；
' l) b* ^( w% l8 \& ^, q2. 将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
7 A, \3 |9 t8 S5 S4 F2 l3. 测读此KCl溶液的pH值、# |( v4 q2 U/ ^5 E+ K  @5 d4 R
  凝胶的固定：
8 m4 T, @/ H; C8 J3 O! L6 O1. 将凝胶于10％三氯乙酸中浸泡10min；
4 r+ ]( P" o9 f9 {+ q0 ^2. 换成1％三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。
3 g! U: U# F, F# V& ?   凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。

天然等电聚焦电泳的修正方案

6 l  q: B  i4 K     如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；
! s% p4 f5 w4 }8 y  ]9 i+ I3 ~1. 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；! F# o" o% I( R# h. P2 |
2. 上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200ul载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；
$ |8 ]7 _4 X3 }+ ~. }/ \$ A5 h3. 室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。

等电聚焦注意事项

+ H# Y8 {+ d# u% H8 x1. 等电聚焦后可用一根染色的细线（0.1mm）标出染料前沿的位置；
; U# y8 E+ Q7 H! n& W0 J2. 不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别，使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若要获得最好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌；
% C; v9 w% V1 A7 Z; d) S- C! D3. 通常，窄范围的pH梯度可以提高分辨率，但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的选择；
1 E& c- l, E8 w* |0 B; p4. 由于电源和凝胶冷却系统的限制，最长的凝胶长度为8－10cm，实际上，分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好；9 a. e3 F- G4 C! T
5. 当等电聚焦电泳时间很长时候（〉3000V·h），由于载体两性电解质不稳定造成的阴极漂移将成为严重问题，阴极漂移会破坏pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，为了克服此问题，开发了一种较短时间（1600V·h）完成等电聚焦电泳的技术，即非平衡pH梯度电泳，这样可以在高pH范围内聚焦蛋白质，但该方法不能用来测定蛋白质等电点。* @/ J/ Y& j6 c/ s8 U* e+ C
6. 尿素可以促进蛋白质溶解，并消除蛋白质－蛋白质及蛋白质－脂类相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同时抑制阴极漂移，但是也要注意变性蛋白质的等电点可能同天然蛋白有所差异。1 h7 E" W0 V& P3 c9 ~( r- n
7. 若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至终浓度8M，在高浓度的尿素下，SDS同蛋白质的相互作用极小。
1 |" _& e8 l) W4 E6 M1 b8. 在变性液中加入2％Triton X－100以保证蛋白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent3－14等两性离子去垢剂；
! ~$ ]" T1 F2 E7 G9. 超薄凝胶（50-500um）比常用标准等电聚焦更有优势，因为高电场强度和更佳的冷却效果使聚焦速度更快，分辨率更高。/ o0 ]* e2 {8 w! a$ P7 w: c9 \4 V
10. 在聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶中，高分子量蛋白质（〉750kd）常常表现异常的迁移行为，琼脂糖凝胶或琼脂糖－丙稀酰胺凝胶较适用于高分子量蛋白质。
+ i- v  n* O' d$ M* N  V) D11. 考马斯亮蓝染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗涤凝胶10-30min可以进一步改善染色效果。SDS同载体两性电解质结合后可以更好的去除载体两性电解质。

固相pH梯度等电聚焦简介

$ n/ N1 }$ o- ]. f4 _　　固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。

固相PH梯度等电聚焦电泳

; U+ ?; W1 X* S4 L仪器试剂
- E; t$ L# l1 t1 q  D　　仪器：Pharmacia公司IPG Phor系统$ e6 Y) m" [/ l+ a/ Z$ f6 c
　　试剂：
6 g2 M+ K- N6 s+ ?6 ]1. 丙稀酰胺；
6 D7 a0 q/ f6 Q& n: e) X2. 双－丙稀酰胺；3 \9 O! Z% i& c& e  V  u2 @3 T
3. Immobiline II；+ p8 a2 t3 \' n% L
4. 过硫酸铵；! s# `! `- P' V4 n, |
5. TEMED/ y2 u8 ?9 d. e: d; A6 m" [3 _! E
　　储存液：8 P5 }; P9 A: A% b7 i
1. 溶解14.55g丙稀酰胺和0.45g N，N‘－双甲叉丙稀酰胺于40ml双蒸水中，溶解过滤后定容至50ml，4摄氏度可以存放2周。& v5 F/ a6 W6 p/ y. k. s
2. Immobiline II，使用前将储存于4－8摄氏度的Immobiline II溶液于室温下平衡半小时。+ s* X7 X7 x8 ~4 [
固定化电解质的选择
- X9 {# A  L$ k% N/ d/ @/ e" k; M3 a　　固定化电解质可以分为酸性和碱性固定化电解质，分别含有一个弱的羧基和氨基，商品化的固定化电解质有6-7种，但是实验室已可合成不同pK值的丙稀酰胺衍生物17种，利用不同pK固定化电解质的组合可以配置不同pH范围的凝胶，甚至一个pH范围及小于一个pH范围的凝胶，现在已经可以从10种不同pK的固定化电解质中选择缓冲离子和滴定剂，设计pH2.5-12任意宽窄范围的pH配方，也有很多中pH范围商品化的固相pH梯度凝胶出售。 5 X. M) K2 t+ N1 j! i
　灌胶：
6 w& J! n) a& C7 V2 m/ \1 e0 E通常将酸性固定化电解质作为重液，碱性固定化电解质作为轻液，下表为凝胶配方：                     
& q' [& ]- J; H% t表2  固相pH梯度凝胶配方( ?2 c% n6 Z; L: a  W' T6 x; X

贮液 0 Z# a9 A. y& t! ^4 @	重液（混合腔） # a# Z" N# v% e( y" D0 _) W5 X' Q	轻液（贮液腔）( |: \' ]  e* h5 z; G
缓冲固定化电解质 - Q# Q) N; X  M( A	ul6 \/ Q, Q. y. v, M6 J2 k4 Q	; n8 D. \' }7 B# z' B& Y6 E/ N ul 7 n" M: {/ O+ a+ x, \+ W; o
滴定固定化电解质 ! R: W% r' |# D) j" ^: u: ]8 Y: ?	ul 6 E1 r" B' u9 T6 {7 f	ul' w0 i' F: E3 U8 \7 p
甘油 * E4 R7 O; D$ h; G	2.1ml " j7 M, H9 c% E$ E0 b: U5 `	―― : G' Q6 a$ o& s2 i. \& t- {  K
丙稀酰胺单体贮液  m9 x+ v, V0 z) y/ k7 V! w	1.25ml& h! g3 w/ L8 x	1.25ml6 S2 L, {! k1 ^" e+ B7 I
双蒸水定容到 9 n, F6 ~2 [1 }8 G* W	7.5ml1 `& G; I; _9 H. c" I! {	7.5ml & }% v. N* f, n1 Y& y

7 D; J; @5 v6 r. H0 Q) k不同pH梯度范围加入的固定化电解质的量不同，参见下表
. T1 d, W$ F' o           表3+ s" u- m* k! q# F  d9 N' E

! O" G5 @9 Z) X+ ^8 N: b

酸性溶液体积（ul） 9 z9 @9 M) A7 ?# U: e8 B

碱性溶液体积（ul）/ d, g5 |3 D6 t  b9 q4 b: R

0.2M固定化电解质pK5 c7 |5 [: D& ]

0.2M固定化电解质pK 7 o5 K2 [$ F9 v5 J

3.6   @% W  {! ^, Y+ m+ f

4.65 X3 K6 Q, \0 t0 Z8 Z

6.20 Y0 D, ^, r& {8 R+ v$ L

7.0) w- ~7 q- G6 o. K' L6 v

8.5 ' I8 {' V$ Y  U# o1 S, _

9.3 # t: m/ c1 R- Q! H/ l: h4 n& h; _

pH范围& n8 z, m, X) W! h4 f  s

3.6, H  Y3 J+ G4 S0 P5 I; P. W

4.61 `9 Z# s, ]  q$ N# G; V5 z

6.2; s5 ]4 [7 v; j5 y

7.0   b, o- `) `; w' w: Y

8.5: h- v& X9 k3 V' K

9.3$ d$ D8 T5 M6 C  A: x' ^8 c

299' G* W9 n& ^% a2 _  v- p) k( {9 u

223 3 w; b# N/ U  f; H

1572 V( w8 @9 H/ n% N& w- x& L0 s

5 J. E3 |4 Q1 Z# G1 I

2 v4 U7 G  ~( v

2 z( s- f+ d3 K; P: c! G6 A5 g$ k

3.5-5.5$ x; h, m0 g3 b5 g" U( @+ {

212! |% T7 F+ G3 j0 U1 ^0 {: {4 r

3105 v5 B- K" u1 n) y: w* V

465' x7 }) J' q. A

9 V8 R3 P1 c: a

7 ~; R! r! y; k: w2 M, Y* `

( K5 c; g' c" V: v/ N8 a

569 ' P4 U8 e4 |4 R( h

99 - R2 n+ ?* m( K; ?0 C

4391 ~0 V% b. }8 q4 l9 r  o9 e+ b

' @) o3 u. x/ [' e5 v# {/ i6 B

, D" k' R' x/ E2 `& ~

! j% A, [. C. m( L1 w* K2 I0 B& y& p8 F! W

4.0-6.0$ L( i/ E, g. ?  L* C4 s

390- q  m" H! \; i4 y! K( {

521 # W8 A% Y  K* o$ A) c6 z9 }$ u

276 3 g* Q$ L% G* S, g0 t' J

! n$ L& T3 L* R( \" b  n

$ U3 j2 q+ _; Y: [# Q5 M

722 " p' D! g' o6 L8 K/ p8 Q# n! M

415 ! {* U. u* c+ m0 A

240 5 u8 C+ \; F( C+ m+ a

499 " l+ o! }; F" d3 s- N, o

# ~6 l9 p. V; ~; X

! t* w  v" b4 V2 B& a: g* _- o

. Z7 E4 f; ~6 `8 J5 O  F) y4 Z

4.5-6.5 1 l$ M) u) y1 Y' r4 h4 h

7 D" R. x6 o! t

570  a; P; P' W! L, c  |

244 % {+ I; U9 Q4 s; S

2356 a$ _& ]- a3 m1 X1 f0 u+ _

3 K! D. V6 H: {

297/ p% F  @. r$ T8 O$ a( I

69 , ~2 |6 V4 D0 Q* m

428 8 w+ |8 w1 S6 m, g. m1 c9 F# }+ i

414! w% e( R8 L: i) F- L4 J: ?

# q' ?3 U& o/ E4 I- s/ Q. m( m

4 A( ~# {$ c+ [1 q$ q2 G

4 |. p/ n/ B5 J: K

5.0-7.08 U) x& P- v" t1 R) @* v7 {8 q

# `: Z) f+ n2 T- N+ G

474 / ^& S2 ^, {0 J2 O* {; t

2709 s5 X- j+ ]9 B/ G! E& I9 V

219 4 [  `9 A  F+ q) L. c) P

3 D) {- C# v8 h0 x- i) Q

320) m# ^# E# R  U' }% c0 T, w( g

, D7 z0 h3 _* \, H3 U9 Y

450 - w# P/ ]0 m+ M" R( P* O

3544 P3 Z: Y/ h( [0 [

113! x* M: B. U" R6 i

1 O; v0 t, D  i% ~1 o9 f

9 x) I& K& X- M/ H3 s3 e  V

5.5-7.0 / P% h; i% J$ ?) @5 h1 n

3478 @. j! J; c7 R6 U4 H

1 ~3 T! c( p6 J( N; `% h5 ?: g

236 / d. ^: m; L' a" b$ O" {! F/ }* y

2873 ^, N0 U- P; F: N5 m

284, E9 @+ h0 ]- I* ~) I

, x2 }" C9 Z" r9 ~# k

435 ; u; G% ~6 D( Q6 _

4 y! D( V" P4 X2 Q0 j% A

323 - C2 `  X4 P6 h0 V5 T+ U; o

208 # M; N; y5 W2 `3 V

44* f. P: t6 n+ H% C$ U/ B% f: I

" i  Y, y5 [7 B8 H# \

6.0-8.0: G) e# D7 Y" H  q* q3 |

2860 _( Q; x# q6 c% e  @# T, i: d

. Y$ s" |6 H& j& h! G

174 - D3 B9 |/ K4 i8 O! P

325' @8 ?. T2 }' \! r

329' u2 P8 U( K8 ?' v1 D9 f

$ h& f0 D2 u- T/ c  S2 @

771, V( D# S7 X3 q! X

4 i" H/ U% B4 ~- `7 V/ N

276 6 U" w6 t' K! a* a3 @$ C- m

185 ( k: Q, ?. J+ e2 D

538 ( Y. s7 k; ?3 t( f4 W) F" I

4 m: D$ z* Q4 W. u+ O1 o

6.5-8.5. ^/ l0 h6 Q% P% Z% ?

192' f- X0 M- W2 F

( a2 O5 \0 |% V  u% _

153' d2 F) R6 n) N4 y

278 , g% o' F, O1 v* _9 ^

362' I" {- A' M$ ?; i! u

: T+ m7 O  u/ `2 m4 ~( J7 g9 B

13499 O' I" u  a% ^( w

+ g* b& u# S8 f/ C3 m* M

2723 L, b* f$ Z2 r4 y4 J+ n  \# _" @  [

372 ' E% B) x" X5 l# e# P

845! z$ x2 [+ ^1 c

: |8 E, @1 e% x' N8 o

7.0-9.0: q! u* {* B; ]8 `

207 9 E. C( ]$ q/ x* ~5 \* G

6 N1 r$ T, g; z' Y$ i

! r! D: [4 e0 u; [

925 : i- h! p' a' E/ Y

139 ; f- d8 R8 v' E& F5 w( x# @2 g' x* n. }

346 6 s) q" }/ T) H2 ~# U

399, K. Z$ W* Y, v5 e0 p  M( ]0 u; V

, D( ?- X' O4 n6 n( B

" Y+ P* d8 R- G

364 5 I$ t+ C$ x) `

355 : k$ q; p, c( U) w9 P- Q% `

94   f7 y* T. ?" k6 Y7 d; U

8.0-10.0: }+ A% x5 U4 {* i2 a, n$ |1 ^/ o

919 h% E+ p# G/ n6 l  T- K- z

9 t$ ^% B; W8 k- B- o" P

, t1 g1 \8 I4 B" Q0 }0 _1 ^

329  ^0 ~1 `& r) K9 C

366 3 c0 Q8 q3 X6 J& ^: t  T9 q

289% q9 \2 B/ r' \. j  w  r

587  X. ]! _$ ~6 F

110 7 s7 l. y3 d8 b0 t& f+ n

450 ! X+ h1 D2 U' }$ V) J$ n

" F$ l2 A  Q2 v  m+ i4 }4 h9 r6 _# v

- Z9 ?# o* x, k, T

% [3 }: S: M8 t# P7 q6 R, Q

4.0-7.0 & p/ R) S2 ~6 n; G3 J

302  D. n0 M: o: G

738) v% ]' I0 O- S3 ^: M+ V" R

151$ g6 [) l- I" B& ]5 b, ~  P! A- |

2697 h$ Z9 }6 |4 O9 x' _: I

; n2 M$ ?( ?' o' T6 U8 `

876 . |- W( Z) z( Z* i+ o! y; W

702 3 U/ W' O2 z  @  x

254 3 r6 t) u2 X6 s; F9 Z. l2 _

416& A1 G' `& u6 M8 h  R/ p5 ?

133 ' N1 Y# @$ N2 f8 X* E! y

346, O. G; y: s( @8 O8 Z

& Z. ~# b2 q5 a# V6 _7 d% k/ t3 Q

5.0-8.0( w) Y- s; s8 r

175 + ?0 \% C5 q& O2 q# j( _

123* x1 F  H- c9 u9 d4 q% R4 f

131! K! s3 w# z& I( a+ Q, }6 z1 q$ g8 C

345 ( q  c9 e& n" e2 b' U

346 ; m: |" R/ b& |+ A+ I8 j, b+ I0 D4 O

$ y! T4 _" Y2 `# m) j$ d- h  U: v

779 - L$ \* F2 I+ |' @3 f

: L) t; K) j/ L# _! p( L0 x

402 3 w/ i* W  Q* q5 Z. v" k0 k

93 , N* r' U2 t; }; E

364 - D0 D7 M% C5 D3 O) p1 x# j0 d+ o

90$ x" t8 O# n" y

6.0-9.0 4 {0 B8 w* J( @% R7 u9 @

241 & y/ W% f, N; ~; K" u+ ?

' c5 k; \" t6 \/ M$ S$ w" j! d

161 & O/ F- h0 f9 M" u8 ]

449( e# b6 f; c, j( L! k6 E

237 . w- B& I% @- z

2253 N/ g; G3 v0 ]0 I

542+ F3 Q3 S3 V6 m- V# n0 x

+ W6 s; T% k3 u. s% f

! E3 e) P/ \/ I6 q% c8 _

3780 X: q$ ^; N9 Y& H+ \! f

351$ Y/ s+ x5 i6 J1 u9 N. e

$ ^, U5 }( [) g0 }) b/ g2 s

7.0-10.0 3 [8 L/ |! y7 `# e" g& f, N

90 * i& J! N  b2 S

0 i3 ~0 v7 M- f; @

6 Z( F2 V) E/ ^* ~& ?8 ~

324! S9 B2 M6 K' \6 K7 }% i3 O

350 2 e% n! n" {! q8 a

2804 A- e. G( F; `: y8 B: z

588$ n6 u5 \: X9 X5 |$ \, P

254& n) v8 h/ Z; K& M- b$ T8 ?

235# R; q8 H% E7 z

117   V8 R7 [& ?: |6 D+ g& H( s4 a

170 3 H1 c; _4 y( J1 V

( A1 F/ V$ ?$ C! c

4.0-8.0 - g7 `( g8 w5 v! `

7 V- w; ?2 G! U8 n

554. U1 \- X- b7 r, s+ X2 [