分子诊断技术
& k, H( d: z: x8 D" R, C  H+ G

主要内容：
0 D7 o, Q4 K2 S4 N1．分子诊断原理
1 ?; i6 r# Z% c- Q: X2．分子诊断实验方法0 e7 {) K# M& U) u$ ?& I& l
3．分子诊断技术前景及应用' S: ?2 X. M8 p% R5 V& l2 R9 a
4．肿瘤标志物检测原理
6 B. `: b# \$ |$ G6 M5．几种重要肿瘤标志物及其应用- D2 |& B# U9 _2 L6 I: Y
6．基因诊断原理
, ?  j/ P2 K) ?+ \; U7．基因诊断技术方法分类
: W" u+ S% u' h2 ?# W8 g. x  p8．基因诊断技术的选择  `1 c1 `( ^1 i, }, d/ s5 `
9．基因诊断技术的质控指标" G) Q( h: ~( B, ?
10．基因诊断技术应用
5 E6 e6 E' |1 h9 I2 X+ Z+ R11．分子诊断之PCR技术
7 `# F' h$ ?( p* `+ `+ S8 n12．PCR技术在病毒学中的应用
; o# u/ x1 t; w4 @: Q' @7 `8 W: S! z13．PCR技术诊断HIV感染
$ X' `& |, L" b14．PCR技术诊断骨肿瘤) ^  b5 {5 ^6 G2 j$ x: U
15．PCR技术诊断结核杆菌) a% P, W0 n7 V, E) g
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致谢：
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5 q4 _- Y8 @% L. S7 f3 E% M  @; G8 x$ P; W5 H0 o
主要参考资料：7 w. k. O/ c/ Q( s9 _+ z* g3 \
《肿瘤的分子诊断与预测》钦伦秀% B) r; M$ A2 q
《分子诊断学》 帕特里诺斯
) s1 e* O7 C: R. j9 A, r《分子诊断学》吕建新5 m/ a+ w+ d& b, X# S! e# ?( T

分子诊断技术原理. b0 A- u1 a/ ?9 i$ F1 G/ g

+ M9 H- }# u! `0 }; q        20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生，70年代以来，分子生物学已成为生命科学领域最具有活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床，在疾病和预防、预测、诊断、疗效地评价等多方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透，产生了一个崭新的学科方向—分子医学；70年代末，美国科学院院士美籍华裔科学家Kan等应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代，由于基因诊断是从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进行检测，因此实现了疾病的早期诊断，但由于基因诊断方法以现代分子生物学技术为基础并有机整合了细胞学、遗传学等技术，使基因诊断更具有先进性，精确性和快速，因此大大提高了诊断的特异性和灵敏度。. ^$ }9 I( C& n$ R) [# z
        长期以来，疾病的诊断主要依据病史、症状、体征和各种辅助检查，如血液学、病理学、免疫学、微生物学、寄生虫学乃至物理学检查等。然而，上述检查方法都具有其各自的局限性，使得许多疾病未能被及时准确地诊断，从而延误了治疗良机。因为许多外科疾病在病人出现症状、体征及生化改变之前就已存在相当一段时间，所以人们一直在盼望能找到一种技术，在疾病一旦发生，甚至尚未出现症状、体征及生化改变之前，就能做出诊断；对于某些可能的致病因素，包括食品、水质、环境中存在的病原体，人们也期望能有简单准确的方法及时进行检测。随着基因诊断技术的不断改进和日臻成熟，其涉及领域和应用范围不断扩大，特别是80年代中期聚合酶链反应（PCR）技术的问世以及90年代初人类基因组计划的启动，进一步推动了基因诊断技术的发展。分子生物学技术的发展使人们渴望已久的上述愿望得以实现，1999年11月，美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志，标志着这种在分子生物学理论和技术发展基础上建立起来的一门全新的诊断技术已经发展成为一个成熟的学科——分子诊断学。
) w0 A6 y) N: Y( t3 n        分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据，回顾分子诊断学20余年的发展历史，大致经历了3个阶段：
* _' D! x9 R  R! c/ p& k        （1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；
  D; ~+ s. D, p% F' p. f# ]        （2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量。
6 Y  |. m, S1 ~( r! [        （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等，由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法，不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点，而且具有广阔和应用前景和商业价值，因此成为分子诊断技术领域的一大热点。& w6 e% k' c3 \  F
分子诊断学的发展历史已揭示了其发展方向：8 Q2 Y# a2 j" v" {
        1）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）的全面诊断；
) z" X+ D/ P. p% @- C. M% c        2）分子诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；$ L" O% p- q$ o, [* @3 h
        3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟；
( B: t% N" h/ q1 N0 }( t* G        4）分子诊断的范围从单基因疾病（门德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断；
8 s1 ^& m& O0 E9 ~6 }7 u# V        5）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾病基因或疾病相关基因的筛查。9 Y9 e; e# ^7 V' {5 J# }3 ^

+ G! m8 S. ?' L- n4 x) N[ 本帖最后由 microfox 于 07-9-10 19:21 编辑 ]

分子诊断实验方法

# {3 ~, Y$ g' ?" j6 T9 y
" U2 {. Y5 A: \  X* z2 t9 j
       生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白质，通过从分子水平上完成DNA, RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。
/ n8 p3 y  E" K' Y; ?6 I$ Q$ P+ A       （1）基因诊断
8 ]6 k2 z7 @; y, c" ]# E       基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。 人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组DNA，应用恰当的DNA分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。基因诊断检测的目标分子是DNA或RNA，反映基因的结构和功能。检测的基因有内源性(即机体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌等)两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。
4 f& J: ?; A  d& b       基因诊断的意义在于不仅能对某些疾病做出确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。+ e; n2 n# H4 i0 @
       基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。
2 P5 h/ L# I7 B3 H       1．核酸分子杂交技术0 [8 M; a( ^, D; H0 r( _6 b
       1）原理：1 x6 F! w& c( B& T5 M! M8 m& A
       具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。9 W2 q& C! c0 ~5 h+ o( Z4 {
       2）基因探针及其标记：
7 J6 P8 u+ v1 M8 h       基因探针是一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，长度不一，可为完整基因，也可为其中一部分。根据探针的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链(或通过变性形成单链)，二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。在与DNA样本杂交过程中，借助上述标记物可探察出特异性或差异性DNA。双链DNA的变性和复性特点是本技术的基础。经加热，或在强酸、强碱作用下，双链DNA氢键被破坏，双股链分离，变成单链（此即变性）；而当条件缓慢变为中性或温度下降（50oC左右）时，氢键恢复，分开的两股单链又重新合为互补的双链结构（此即复性）。DNA探针分子杂交就是将样本DNA分子经上述条件处理后，使其变性为单链状态，固定在载体硝酸纤维膜上，再与经小分子标记的DNA探针单链分子混合，在一定条件下使它们互补杂交结合。将未杂交的成分洗脱后，标记物显色，即可观察结果。选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。' h. j7 d" h* [- @+ |( ~* y$ o& X5 ]
目前，DNA探针已用于疟原虫、隐孢子虫、贾第虫、锥虫、巴贝斯虫、弓形虫、丝虫、血吸虫、棘球蚴、猪带绦虫、肝片吸虫和猪囊虫等虫种的鉴定和相应疾病的诊断上。. A, _7 i) P: [9 W# f
       3）常用核酸分子杂交技术：①Southern印迹杂交；②Northern印迹杂交；③斑点杂交( dotblotting)；④原位杂交(in situ hybridization)；⑤夹心杂交(三明治杂交)；⑥液相杂交。0 R. N9 F# |# K+ D2 p* C: g! n$ T
       2．聚合酶链反应(即polymerase chain reaction，PCR)
0 e+ K9 w; {' Z) }7 W+ w4 H       PCR是在引物介导下特异性扩增DNA的技术。它包括模板DNA热变性解链—引物与模板DNA退火—引物延伸3个步骤的循环过程。其基本原理是在实验条件下，根据温度的变化控制DNA解链和退火（引物与模板DNA结合），在引物启动和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定区域内的DNA链。上述“解链—退火—延伸”3个连续步骤为一个循环。经过20 ～ 30个循环反应，可使引物特定区段的DNA量增加至少105倍。
5 K6 h" [( M0 |( U6 B) ^: G       1）原理：. A; f3 v* f/ B
       PCR是模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤：双链DNA模板加热变性成单链(变性)；在低温下引物与单链DNA互补配对(退火)；在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。
* C# p2 @6 }# L       2）PCR引物：0 X* ~$ w" H( H/ X4 }, `6 @( i8 e( P
       PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物设计决定PCR反应的成败。由于致病基因是在正常基因序列中发生点突变、片段插人和(或)缺失，基因两翼的DNA序列和正常基因仍然相同，因此根据基因两翼的DNA序列可设计出各20个碱基左右的一对引物。
$ N) h, p- \& G, c; `3 N- n       3）常用PCR技术：) s( m- b' O4 r7 N1 t
       利用PCR技术，在适当条件下扩增目的基因，然后分析PCR产物，便可判断其是否为致病基因及其变异性质。此外，PCR具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、样品处理简单等优点。反应过程可在PCR仪内自动进行，根据需要目前已衍行和发展出以下方法：①常规PCR；②复合PCR；③反转录PCR (RT-PCR)；④原位PCR；⑤反向PCR；⑥膜结合PCR；⑦彩色PCR；⑧定量PCR；⑨固着PCR；⑩免疫PCR。
9 ?/ T7 _/ ^' ], }* W4 b# }+ F( O目前，PCR技术多用于寄生虫病的基因诊断，分子流行病学研究和种株鉴定、分析等领域。已应用的虫种包括利什曼原虫、疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、阿米巴、巴贝氏虫、旋毛虫、锥虫、隐孢子虫、贾第虫、猪带绦虫和丝虫等。$ O0 P& N5 U( ?  ~
       3．生物芯片技术
+ N2 S; X" O- u' D/ E       生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。
: _/ l- n6 s: r6 J% _# S% Y       基因芯片技术（gene chip）它将集成电路、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、荧光标记探针等技术结合为一体，使众多的寡核苷酸探针有规律地排列在硅片上（探针密度可达105/cm2），用其可与带有荧光标记的DNA样品杂交，再通过计算机分析荧光信号获得待测DNA样品的序列信息。基因芯片技术大大提高了基因探针的检测效率。在寄生虫学领域，本技术还处于研究之中，目前线虫基因组芯片业已问世。 + e$ r6 z  r! j2 O
       N八芯片技术的基本原理是将cDNA或寡核苷酸探针以105 ~ 106位点／c耐的密度结合在固相支持物(即芯片)上，每个位点上的cDNA或寡核苷酸探针的顺序是已知的，将该探针与荧光标记的待测样品DNA、RNA或cDNA在芯片上进行杂交，然后用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对杂交信号做出比较和检测，从而迅速得出所需的信息。由于它携带信息量大、体积小、分析过程自动化、分析过程快及所需样品和试剂量少，因而具有广泛的应用前景、迄今能在临床上用于疾病诊断的芯片主要见于传染性疾病，如丙型肝炎、乙型肝炎及艾滋病等少数几种疾病病毒检测芯片。如果将该技术广泛用于疾病诊断，目前仍存在较大困难。原因在于当前对基因功能的认识仍不充分，而且疾病的发生与很多因素有关，要从大量基因库中筛选出疾病相关的特异性基因制成芯片，难度相当大。
: ]9 E' s6 e' _1 s       （2）肿瘤标志物检测( H5 B0 n/ ^% I/ ^5 X, m1 j, P
       肿瘤标志物是指肿瘤细胞和组织由于相关基因或异常结构的相关基因的表达所产生的蛋白质和生物活性物质，在正常组织中不产生或产量甚微，而在肿瘤病人组织、体液和排泄物中可检测到。此外，在病人机体中，由于肿瘤组织浸润正常组织，引起机体免疫功能和代谢异常，产生一些生物活性物质和因子，虽然这些物质和因子特异性低，但与肿瘤发生和发展有关，也可用于肿瘤辅助诊断。$ K  P6 g. H: B/ x, W
　　1．肿瘤标志物的测定方法+ Z% W$ @2 E/ }0 L' F- M7 H
　　1）生物化学技术：用于测定由肿瘤细胞产生并分泌到体液中的肿瘤标志物，因其含量与肿瘤活动度有关，所以适用于绝大多数肿瘤病人的监测、疗效和预后观察。* I- ^; R2 y7 m- X
　　2）免疫组化技术：可从形态学上详细了解细胞分化、增殖和功能变化的情况，有助于确定肿瘤组织类型、预后和临床特征的分析。
) }* j' m4 O* j" E8 i8 h$ |　　3）单克隆抗体技术：临床上已用于甲胎蛋白(AFP )、癌胚抗原(CEA),前列腺特异性抗原
% _/ E1 S! H  A  L, ?& }" y　　2．肿瘤标志物分类
. Y( g2 U  t5 D　　1）原位性肿瘤相关物质：在同类正常细胞含量甚微，而当细胞癌变时迅速增加，如各种癌细胞内的酶气: ~' [+ E0 D; C; q( ^$ c% u
　　2）异位性肿瘤相关物质：是由恶变的肿瘤细胞产生，不是同类正常细胞的组分，如异位性激素、在肺癌时促肾上腺皮质激素(ACTH)明显升高。5 |4 W1 a5 u1 `/ h1 P
　　3）胎盘和胎儿性肿瘤相关物质：癌细胞的特点是无限增殖，并向周围组织侵袭和转移，甚至向远隔组织转移，而胎盘绒毛细胞和胎儿组织细胞也有这样的特点。当胎儿成长后，有一些物质就消失，如果成人组织细胞发生癌变，这类胎盘性或胚胎性物质就会产生或表达癌胚性物质，如AFP、CEA；癌胎盘性物质，如hCG(人绒毛膜促性腺激素)等。8 s1 j: N% l" q; K
　　4）病毒性肿瘤相关物质：凡能在人或动物引起肿瘤或细胞恶性转化的病毒，均称为肿瘤病毒。与肿瘤有关的病毒有HTL-1病毒(成人T细胞白血病)、EB病毒(Burkitt淋巴肉瘤)、HS病毒(宫颈癌与皮肤癌)、HB病毒(肝癌)和人巨细胞病毒等。% d: ]; K3 U. Q1 u4 V1 Q
　　5）癌基因、抑癌基因及其产物：各种致癌因素诱发基因激活和抑癌基因失活及其表达产物异常，是肿瘤发生、发展的重要标志。
0 R0 I3 n( U- R% }　　需要指出的是，同一肿瘤可含有多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型除有共同的标志物外，也可有不同的特异性标志物，即某一肿瘤的标志物对另一肿瘤来说不一定是标志物，而某一组织的正常产物对另一组织来源的肿瘤却可成为较好的肿瘤标志物。, c2 U! O* U- r9 K3 P) K
　　检测肿瘤标志物的临床意义在于：早期发现或诊断原发肿瘤；筛查肿瘤高危人群；鉴别肿瘤的良、恶性；判断肿瘤的发展过程；观察肿瘤的治疗效果；预测肿瘤的复发和预后。

分子诊断技术前景及应用

; Y- J' i# o) P
9 K$ T1 ]+ N8 b( V/ Q       分子诊断技术在检验医学的基础和临床研究中显示出强大的优势，例如，在乙型肝炎的诊断和治疗中，应用DNA定量技术为乙型肝炎的治疗和预后监测提供了重要依据，但近近不无症状乙型肝炎表面抗原携带者及乙型肝炎表面抗阴性者的人群中检出了前C终止密码子变异（G1896A）。研究表明，突变将导致乙型肝炎病毒继续复制，因此这一信息对于临床诊疗十分重要。又如庆大霉素等氨基糖苷类抗生素的毒副作用之一是诱发耳聋，且已证明线粒体DNA中12S rRNA基因A1555G突变和C1494T突变是氨基糖苷灶抗生素诱发非综合征耳聋的分子基础，即只有带有突变的个体在使用氨基糖抗生素后才发生耳聋，因此，检测12S rRNA基因突变对于指导临床用药具有重要意义。再如，最近我国研制的一种传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征（SARS）病毒全基因组芯片，覆盖了SARS病毒基因组的全部序列，旨在检测SARS病毒的同时全面监测该病毒全基因组变化，这种病毒全基因组时代。蛋白芯片，特别是免疫芯片（immunochip）等分子诊断学新技术的快速发展，又为肿瘤学（检测多种肿瘤标志物）、内分泌学（检测数种不同激素）、自身免疫诊断（检测各种过敏原）、血液学（输血筛选）及环境微生物监测等提供了新方法和新思路。2000年，Joos等应用免疫微数组实现了18种自身抗原的诊断；2001年，Huang等实现了基于抗体微数组的24种细胞因子的检测，这些新方法和新技术的广泛应用，不仅为临床医学提供更丰富、更有效的数据和信息、而且有利于临床医生对疾病进行全面分析，为实现“疾病以治疗为主转向以预防为产”奠定了基础。1 R- c+ J' E8 l1 W0 o2 h. K! b1 G
       分子诊断技术虽然具有特异性好、灵敏度高、针对性强、诊断快速等优点，但其存在操作复杂和难经进行临床检验诊断，需要解决的关键是方法的标准化。《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志曾在2001年基因技术用于疾病的诊断。FDA将着重检查评估家系遗传分子诊断的方法和实验室资历质等；实验方法的原理、步骤、应用范围报告方式，以及与临床诊断一致性等因素进行证，并在全美建立一个完善的遗传学检验的质量控制体系，规定报告模式和回馈给被检者的信息范围。专家认为，实施这一计划的目的即为了安全、有效、合法地进行分子诊断。我国各实验室建立了很多的分子诊断方法；有的已应用于临床，但往往存在方法不够成熟和稳定性的问题，也缺乏方法学的比较研究，导致检验结果难以为临床提供确切的信息，近年来有关部门已开始对感染疾病的病原微生物核酸的检测进行了管理，但尚未涉及致病基因检测领域，因此，建立分子诊断方法的金标准和标准操作等程序（standard operation procedure，SOP），并尽早制定出一个符合中国国情分子诊断监管体系已迫在眉睫。
, \* V6 u: U% W( P       总之，分子诊断学将成为21世纪检验医学的主题。分子诊断技术将朝着高效、准确、灵敏和无创伤性的方向发展；21世纪是以生物技术为突出代表的生命科学和世纪，分子诊断的技术优势和巨大潜力，尤其是生物芯片的发展，将成为最有希望为改善世界各国，特别是广大发展中国家人们的健康状况做出贡献的生物技术之一。随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动，分子诊断方法将极大的推动现代检验医学的发展，并在更深层次揭示疾病的本质，指导临床诊断和治疗。
, C4 a' a8 `% F' k# ]/ q: a2 Z4 _7 n* d" }9 N4 W7 M
存在问题
- K- w- g1 ?6 t' o# I- l0 ?  E4 r1 @/ r& Z       在分子诊断领域领域，真正应用临床使患者受益，开展的还比较局限，最大的问题是假阳性和假阴性，因此建立费用低廉、结果可靠的、操作方便的分子诊断技术是迫切需要解决的问题，建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室，实现分子诊断标准化；除了要在诊断技术方面逐步实行标准化外，对肿瘤诊断指标也要进行标准化。随着人类基因组计划和后基因组计划的实施，分子诊断技术也将得到进一步的成熟和完善. 材料学、方法学、传感器和装置成为制约因素

肿瘤标志物检测原理! Q( E: J* n+ Z

# Z* b1 ~- H0 r( u8 T  V4 R( D       根据WHO资料，全球范围内恶性肿瘤是人类仅次于心脑血管病的第二大死亡原因，占总死亡人数的22%，并逐年增加。 % ^8 K8 }& W; c" S2 b* D
       10种常见肿瘤：胃癌、肝癌、食管癌、结直肠肛门癌、白血病、子宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌。$ L5 i& i. x( ^/ z5 v' ?0 u
       肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗是患者获得长期生存的最主要途径。以肝癌为例，肿瘤直径＜2cm，5年生存率几乎100%；直径每增加1cm，5年生存率下降20%。肿瘤诊断三大支柱是图像诊断（包括B超、CT、核磁共振）、化学诊断（血清学和免疫学）及细胞学和组织学诊断，而后两者均以肿瘤标志为主要或辅助观察指标。 ' y3 L7 m6 G- }. R! J
       当前，肿瘤标志物的检测已从细胞水平深入到分子基因水平，在检测技术上，它将生物化学、核医学、免疫学、细胞学、病理学、分子生物学等诸多学科融合在一起，不仅使检测的项目有了大幅度的增加，而且检测的特异性和灵敏度也有很大的提高。 / R1 U+ o( g! D' ]
       肿瘤标志物在肿瘤诊断，检测肿瘤复发与转移，判断疗效和预后以及人群普查等方面都有较大的实用价值，而且在肿瘤发生和发展机理研究中也具有重要作用。肿瘤标志物除用于肿瘤诊断外，可为临床肿瘤治疗提供依据及以其为靶，进行肿瘤的靶向治疗及免疫治疗。肿瘤标志学已成为肿瘤学中一个重要的新学科、新领域。
2 S3 t0 S( R$ f       肿瘤标志（Tumour Markers）是1978年Herberman在美国国立癌症研究所（NCI）召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断”会上提出的，次年在英国第七届“肿瘤发生生物学和医学”会议被大家确认，并开始引用。 : n, t! w+ b& \  I1 T
       肿瘤标志物是指由肿瘤细胞由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质，这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中，进入到血液或其他体液或组织中，或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到血液或体液或组织中而含量明显高于正常参考值的一类生物活性物质。不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。
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6 ]& I3 s, C1 L3 A/ _. c肿瘤标志物分类 9 n7 Y# p" }" A( t
       目前肿瘤标志物尚无统一的分类和命名，临床常用的肿瘤标志物大多是根据其生物化学和免疫学特性可分为： （1）肿瘤抗原 4 J% c- S: r- Y$ e" M0 ^
       肿瘤胚胎性抗原：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)。 - h5 `* n. D: r* ~, a
       白血病系列分化抗原：CD系列。
4 `3 I- K# k* M6 ]2 B       肿瘤增殖抗原：增殖细胞核抗原/周期素（PCNA/Cyclin）、DNA多聚酶（DNA-pol）、Ki-67核抗原、Ki-S1核抗原。 * W+ {5 T; e5 @4 G0 V/ T, c7 J  Q
（2）糖类抗原 CA19-9、CA125、CA50、CA724、CA15-3、CA242、SCC。
% j$ |) @, I+ }- t（3）酶和同工酶 乳酸脱氢酶(LDH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PSA)、胃蛋白酶原I、II(PG I、II)。 3 v5 g+ |: r+ A* A% Y' {, z
（4）激素和异位激素 雌激素受体（ER）、孕激素受体(PR)、绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、降钙素。 / x  c; _* F7 s; A/ a  \  t
（5）蛋白类 角蛋白(Keratin上皮来源肿瘤)：角蛋白19片段（Cyfra21-1）、组织多肽抗原（TPA）、组织多肽特异性抗原(ＴＰＳ)、膀胱癌抗原(ＵＢＣ)。 $ M* q4 X$ y6 C9 W8 @4 _; Q2 c! p
       核基质蛋白22(ＮＭＰ22) 、ＤＲ70（是一种环形结构大分子蛋白质）。 : V* l: H6 y# k6 k1 m9 ]  m& m+ z: O
       β2-微球蛋白。
8 O6 Y) f5 R: V6 x& J7 P       本周氏蛋白。 $ I, ?' T# u& @5 S# {5 s& k+ }
（6）肿瘤相关病毒 EBV与鼻咽癌有关，HPV与宫颈癌有关，HBV与肝癌有关，Ｔ细胞白血病-淋巴瘤病毒(HTLV-1)与成人白血病有关等。 # E, b6 C: f- u/ ^2 M
（7）癌基因、抑癌基因及其产物 由于一些肿瘤中都有癌基因、抑癌基因及其产物异常表达，因而是较佳的广谱肿瘤分子标志。 4 p- f' d3 I+ h. n: ?
       1）癌基因与相关肿瘤 . `+ {! l4 s" @( `
       ras家族（P21）乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、白血病等
; d4 Y$ J* w6 k# @8 T' |       C-erbB2（HER-2/ neu）乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等 6 R( ]6 F# t2 M
       C-myc 肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、睾丸癌等 & K8 O% n- O; ]- C; x: u
       C-met 肝癌、胃肠癌、甲状腺癌、肾癌、脑瘤等
! B& N: A! z/ S; m6 T2 p! F' Q5 R% ~       mdm-2 软组织肉瘤
7 n# }  @" \: L! s& p       bcr-abl融合基因 慢性髓细胞性白血病（CML）
0 A, Q  I6 m) A1 h3 l       Ph1 t(9,22)易位 白血病[14] 2 {- {* S1 ^6 [3 b% v
       EGF 对肿瘤有促进生长作用[17] + ]. W, d! U- C4 x" b
       EGFR 乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌、肝癌等 " Y9 e+ b8 `; q" X2 b
       TGF-a 乳腺癌、肝癌[18]等   \( |" E6 ?  W7 |- r
       2）抗癌基因与相关肿瘤
# {8 M1 _2 ~+ l2 h5 {: j       Rb 视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、小细胞肺癌等
3 a, \( v% h$ `       P53 肺癌、消化道癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、白血病等 $ q* A7 |9 y5 v; x9 I% G
       APC 家族性结肠腺瘤病、大肠癌、胃癌、肺癌等 ) e! s% H; s3 D( X  l  y) h
       FAP 家族性结肠腺瘤病、大肠癌 / B. Q& u4 P" ~) q# O$ b# R
       DCC 大肠癌、胃癌
6 _- `3 V+ i' t* l7 i* K       NF1 神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤
. v; F" r3 |+ k+ K8 [       WT1 Wilms肾瘤 " R! T' u5 h9 M, H* c7 z
       MTS1(ｐ16基因)[19] 肺癌、食管癌、肝癌、大肠癌、白血病等 5 j: f9 u/ m* t- J. G
       FHIT[20] 食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌、肝癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌等
  n' @3 E4 U+ e& I       3）转移相关基因 & G: v/ b0 ^% S7 w1 `  q, h
       nm23 转移抑制基因，与肿瘤转移和预后呈负相关。
: x9 [+ H! n# f" W# f       CD44 表达增加，促进转移。 $ e- ~+ N( Y/ g  G
       组织蛋白酶Ｄ(chth-D) 在癌浸润和转移中起着关键作用
1 i' f: ]& w" \       4）凋亡相关基因 ) H* V: D. L; w: [2 w+ o7 M
       bcl-2 抑制细胞凋亡。可作为抗癌药物敏感性及预后指标。 8 {1 U5 x4 E2 m3 }% Z8 |
       Fas 属于TNF家族，该基因转染肿瘤细胞后促进细胞凋亡。
+ B: m, D- U3 [# F8 @* b* m       5）多药耐药性(MDR)基因
. S% e: [4 m0 v1 A. R       P-糖蛋白（P-gp）
+ Y  E, h% [4 z$ r5 Z9 h* @       多药耐药相关蛋白(MRP)
8 s. W' K' r+ p) `% _       肺耐药蛋白(LRP) * y' |- x' I! y. T& l* ]7 E
       谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ-π） + a0 y7 d: m* {, N) x; }$ ]
& c3 {$ s2 g( j- O+ @
肿瘤标志物检测方法
6 S, f7 u7 H' D6 {       同一个标志物可用不同方法进行检测，如可以从血清学水平、免疫组化检测CEA或P-gp等，也可以用FCM或RT-PCR来检测。
- F+ c9 u8 N' s6 N" g       血清学水平：除传统的放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA）外，目前在国内主要有三类全自动免疫化学分析系统（化学发光免疫分析系统；荧光免疫分析系统和电化学发光免疫分析系统）广泛的应用于临床，对血清肿瘤标记物检测具有快速、准确、半定量。可检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f- PSA等。
$ }8 y/ e+ P$ P/ [7 Y4 g6 I# E# `       组织学水平：免疫组化和原位分子杂交组化技术是近年发展起来的一门新兴边缘学科。它将免疫学技术和分子生物学技术同组织病理学制片方法巧妙结合在一起，在组织细胞原位显示某些化学成分和特定基因片段。 * h! U8 S: ^  O9 q
       常规标本中约5%～15%疑难病例或恶性肿瘤需采用免疫组化进行鉴别诊断和预后分析。
3 E4 [' p8 V# _       Porter D利用mRNA原位杂交检测细胞水平基因表达，在组织芯片上免疫组织化学检测乳房导管原位癌和浸润癌病理学特征和临床意义。
- H/ a0 k5 A4 @! H  E9 z       图像分析技术可以定量测定组织切片上肿瘤细胞DNA含量和形态学分析，对判断肿瘤恶性度及预后具有重要临床价值。
% s8 L! B, A6 D" a5 q       细胞学水平：流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）。是利用FCM对细胞和细胞器的结构和某些功能进行定量检测，并利用细胞表面特异性标志对特定细胞亚群进行分析和分选的先进技术方法。检测白血病和淋巴瘤标记物(CD系列)利于诊断和鉴别诊断；用FCM检测恶性肿瘤细胞的P-gp可为临床选择化疗药物提供依据；我们用FCM检测消化道肿瘤外周血CD44水平。 4 ^- k7 D; ?: j8 F1 R- L1 v8 H
       电镜：电镜酶细胞化学技术、免疫电镜技术、原位杂交电镜技术。
# c4 i, x7 ?% E2 S! K       分子学水平：聚合酶链反应法（PCR）是一种极为简单、敏感、高效、特异和快速的能在体外进行扩增DNA的技术。
& H5 x* N6 H' q- g/ U+ J       目前，国内外用ＲＴ-ＰＣＲ方法检测外周血中的肿瘤细胞的主要标记基因有细胞角蛋白19(CK19 mRNA)和20(CK20mRNA)用于上皮性恶性肿瘤；癌胚抗原(CEAmRNA)用于结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等CEA分泌性肿瘤；甲胎蛋白( AFPmRNA)用于肝细胞癌微转移的检测。 ' L3 t) W) d$ r  M% e$ Y
       生物芯片分析系统：①基因芯片。我们做了卵巢癌[27]和食管癌[28,29]基因表达谱的研究工作。Zhu G报道[30]用显微切割和芯片技术结合分析乳房癌不同部位肿瘤细胞之间基因表达差异。②组织芯片[18]。组织芯片可以帮助节省试剂、人力和费用。过去分析一个肿瘤的试剂量现在可以分析高达数百个甚至1000个肿瘤,而且是在同一张切片上同时进行。③蛋白芯片。为多标志联合检测提供了理想的工具，英国RANDOX公司已经在全球同时推出的包含8种肿瘤标志的蛋白芯片。
# D% z: M, H" I! e. w' Z% ?8 C1 ~$ g) i) T9 S, R7 \) C
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几种重要肿瘤标志物及其应用 % m; b3 s" a0 Q# x( f  b2 k5 `& h  G

* K3 N9 P$ @& n. v7 K) K0 E
影响因素：' _  l& R4 n. g2 |1 w7 Q. X- d
      1.肿瘤标志物具有特异性和非特异性的双重特点。
3 u* z% K- m" ^8 C6 B6 C& W      2.各种肿瘤特性的不同，如肿瘤的分期、大小、定位、组织来源及转移趋向等的不同。
. x$ \7 C! Q- [& o  [      3.各种抗体的不同，如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体决定簇和抗体亲和性等的不同。
, E& V5 S4 N: k/ V. G% N      4.各种检测系统的不同，如检测原理、标记物、实验条件、检测技术、检测仪器和检测敏感度等的不同。
5 {8 C- L1 e" u/ _, c0 a$ y      5.检验人员的专业水平和技术经验、以及实验室条件和实验的可靠性等的差异。 + X% p! }& r7 O
（1）甲胎蛋白（AFP） " I$ Q; T) r7 j5 h
      分子量约为7万的糖蛋白，由590个氨基酸组成，存在于胎儿肝脏和卵黄囊。 主要用于原发性肝癌的诊断和分类，以及非精原睾丸癌、畸胎瘤等的诊断，是唯一一种和癌症有明确特点关系的TM。在妊娠妇女和某些肝炎、肝硬化病人中轻度增高。利用亲和电泳和免泳固定技术可将AFP分为Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3型。其中Ｌ3型是肝细胞癌早期特异性标志物,在检测小肝癌和区别肝癌与良性肝病有很大价值。某些病理类型的肝癌(如假腺管型)细胞可能不分泌AFP。 , N8 d0 K* [6 J4 z$ J% k' a
（2）癌胚抗原（CEA）
0 B5 t# k5 m) G2 c9 d      分子量约180万的多糖蛋白复合物，位于胚胎和胎儿期的肠粘膜中。 分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器。首选为结、直肠癌的标志物，特别是大肠癌，其次为胃、肝、肺、胰、乳腺癌的标志物。腺癌常高于上皮癌。未患癌人群中吸烟者有轻度增高。胰液和胆汁内CEA 含量可用于诊断胰腺或胆道癌，尿液中CEA含量可作为判断膀胱癌预后的参考。血清CEA结合甲状腺钙素测定，有助于甲状腺髓样病的诊断和复发的估计。+ q1 _2 \0 t+ h
（3）血清β2微球蛋白（β2 -MG）
* L- l8 O6 b! u! J$ z# a  x; n      分子量为11500的低分子量蛋白，为淋巴细胞、巨噬细胞分泌。临床用于诊断多发性骨髓瘤。在肾功能不良时也升高。 1 M, y5 z9 ?5 o8 \; [1 r; v/ f
（4）血清铁蛋白（SF） " x. U. x2 _1 w! H
      分子量为43-45万的大分子蛋白，作为储存铁，存在于肝、脾和骨髓中。临床为诊断隐性贫血较灵敏的指标。癌细胞具有较强合成SF的能力，可协助对肿瘤的诊断和预后估计。
# p, U# ~( l" G" M" d( m7 s（5）前列腺酸性磷酸酶（PAP）和前列腺特异抗原（PSA）
% E7 B& c. H4 G1 p* z2 W      PAP为分子量约十万的糖蛋白，酸性磷酸酶同功酶之一,是细胞的溶解体和分泌物的正常成分。具有组织特异性，主要用于诊断前列腺癌。& Q0 Q( j, Z# ^
      PSA是前列腺上皮细胞分泌的一种激肽释放酶样的蛋白酶，分子量为33000的单链糖蛋白。前列腺癌时PSA检出率为70%～90%，在良性前列腺组织增生和女性乳腺癌时也可升高。 F-PSA占T-PSA10%～20%，前列腺癌时结合型PSA显著增加，故F-PSA/T-PSA比值下降。 % M; z: S3 H) {# |4 J1 d* J) J1 b
（6）人绒毛膜促性腺激素（HCG）( N! N* Z7 L$ u$ _1 j2 J
      由胎盘滋养层细胞所分泌的一类分子量为4.5万的糖蛋白类激素，含有145个氨基酸，由两个独立的氨基酸肽链α及β亚单位组成。肿瘤细胞以分泌β亚单位为特征。是绒毛膜上皮癌和恶性葡萄胎的肿瘤标志物。在性腺器官如卵巢、睾丸等发生胚胎性癌时也可检出，可作为这些疾病的疗效监测和预后判断。少数肺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌和白血病等恶性肿瘤亦能发现β-HCG升高，但阳性率不高。& [  G9 s7 W* l5 K# S8 X
（7）神经特异性烯醇化酶（NSE）
9 s3 F* g( @$ f. w( Y( {      是烯醇化酶的一种同工酶，分子量约为87000， 是神经元、神经内分泌细胞中参与糖酵解的酶。肿瘤组织中糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液，导致在血清中含量增加。是小细胞肺癌首选的TM(敏感性70%～80%)。在神经母细胞瘤时升高。脑脊液中NSE可作为脑损伤、脑梗死的诊断指标。  0 t6 S1 X  E/ D% H9 h" D
（8）细胞角蛋白相关ＴＭ
$ n" |- |' h: s' K) r; i0 h      细胞角蛋白(CK)参与构成上皮细胞骨架。依其氨基酸序列不同分为CK1～CK20共20种。Cyfra21-1为角蛋白19的片断，适用于非小细胞肺癌(总的敏感性52.9%)的诊断，尤其是鳞癌。
& i1 R  l0 Y& S6 }. w（9）鳞状上皮癌相关抗原（SCCA）   J* ]7 _" s9 v5 C7 R
      为组织抗原，可由妇女生殖道上皮以及不同器官的磷状上皮癌分泌。为宫颈鳞癌的首选TM，也用于肺、食管、口腔、颌、面鳞癌，敏感性比Cyfra21-1低。3 i: Z8 H4 y0 R0 \/ L
（10）胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ（PGI、II）
( c) x& S( [* a0 e! l1 i      PGⅠ见于胃底粘膜的主细胞、颈粘液细胞及主颈粘液移行细胞；PGⅡ见于胃底腺主细胞、幽门腺、十二指肠腺。胃几乎是PG的唯一来源，PG变化能够反映出胃粘膜功能变化。胃癌患者血清PGⅠ、GⅠ/Ⅱ比值明显下降。
8 l/ J0 h2 N- A0 \6 ]+ g: G- e       日本学者以血清PGⅠ<70ng/ml、PGⅠ/ PGⅡ比值<3为临界值,对胃癌的敏感性和特异性分别为84.6%和73. 5%。在对一万余人进行健康体检筛查时发现,有20%左右的人PGI水平降低,进一步作胃镜检查,确认胃癌21例,其中早期胃癌19例。
; x6 v# w0 j/ Y! w& t3 ]（11）糖类抗原(CA) . v3 f/ w* \& D: U9 W' _
  CA19-9 属糖脂，其中粘蛋白分子量为106Ｄ，抗原为3.6×104Ｄ，由各种癌细胞、胎儿胃肠道、上皮和一些粘液细胞产生。' j  L. M) U( F9 R# l. P: ^: \
      在由内胚层细胞分化来的多种上皮类恶性肿瘤血清中均可见升高。主要用于诊断消化道肿瘤，以胰腺癌的特异性最高，其次为结、直肠癌。
7 N; r" {' W, m0 P* A: Q' k（12）生长激素（HGH）! H! X  p+ c6 c& q: Q2 v
      HGH是一种蛋白质类激素，由脑垂体分泌，通过血液传输到全身。恶性肿瘤所分泌的异位激素，如垂体腺瘤、肾、肺等器官肿瘤均会引起HGH含量的升高，因此HGH的检测有利于肾癌、肺癌及垂体瘤的联合诊断。
* @8 z0 Z1 D' N6 A) ?4 |2 i（13）其他
# o3 t; ^# x9 H" k! k8 ~, R      组织多肽抗原（TPA）作为组织相关抗原，主要用于消化道肿瘤、肺癌和乳腺癌等的诊断。组织多肽特异性抗原（TPS）更能提供肿瘤复发、转移和进展的信号。膀胱癌抗原（UBC）主要用于膀胱癌的诊断。
! F( u4 |8 @- f
3 m$ }& |4 y$ k. s几种新的肿瘤标志物% v6 O* d- H" O! k- L5 G+ ^: m
（1）NMP22（nuclear matrix protein 22）
9 W, U8 W4 z. t* s) A      核基质蛋白22。膀胱移行上皮癌患者尿液中NMP22明显高于正常人，有80%的特异性和准确性。尿路损伤可暂时、轻微升高。为非侵入性操作，对上尿路肿瘤的筛选有优势，特别适合复发患者的随访。 2000年FDA通过的ELISA试剂盒，标本为尿液，血尿对检测无影响。
2 x9 u' o6 h4 r/ l- C+ k+ s      NMP22与细胞学诊断膀胱肿瘤的敏感性的比较（G为恶性程度）6 e6 Q' Z/ p) s5 b* n6 ]) x. w
（2）Survivin
5 L4 P: ]7 U* c- G7 C8 ?4 ?. h3 H. w, V      为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），正常终末期细胞不表达，胚胎期及肿瘤细胞表达。各种肿瘤细胞都有一定的阳性率。特别是对膀胱移行上皮癌有100%的阳性率（RT-PCR），特异性>90%。现有ELISA试剂盒（尿液标本），优点同上。
) t& i5 K# ]& e8 I6 z      uPM3) N: B; O# w9 w8 o1 K- z8 b  |3 s
      检测PCA3。PCA3是一个特异在前列腺癌表达的蛋白质，而且表达量大。通过检测尿液中PCA3是诊断前列腺癌的又一新指标。 uPM3试验的特异性和敏感性都超过tPSA仅次于前列腺活检。
" |% V& E$ i/ M% M2 E4 s: w) }0 R2 U# Q5 \6 X+ Z3 t
理想的肿瘤标志物特点和临床意义
) U$ G! D- |: q3 t. p/ p      1）敏感性高 (指在患某种肿瘤的病人中出现阳性检测结果的频率，也就是真阳性率) 能早期检测出肿瘤患者，可用于肿瘤普查。
: t4 Q: W+ B0 \3 S6 o7 _! D      AFP普查在我国是筛选和诊断无症状小肝癌的最主要方法。提高了早期肝癌的检出率和5年生存率。前列腺酸性磷酸酶PSA是第一个由美国推荐用于筛查50岁以上男性前列腺癌的肿瘤标志[3]。 ! D* N/ X( B& r7 x6 ]# M3 [
      2）特异性好 (指没患某肿瘤的人中出现阴性检测结果的频率，也就是真阴性率)能准确鉴别肿瘤/非肿瘤患者。 * c; @' |2 ^. G
在肿瘤高危人群的筛选中，如家族性甲状腺髓样癌的亲属中患该癌症的机会比一般人群高，对这些高危人群检测降钙素水平有助于筛选出可能患早期甲状腺髓样癌的患者。 3 I- e1 Y  v8 |
      3）有器官特异性，可用于肿瘤的诊断和鉴别诊断 PSA不同于其他组织中酸性磷酸酶，可用于前列腺癌的诊断和判断转移癌是否来自前列腺；用CEA和NSE可区别胃肠道肿瘤是腺癌(CEA阳性，NSE阴性)还是类癌(CEA阴性、NSE阳性)；恶性淋巴瘤的诊断和分类：如CD20(L26)-B细胞; CD3-T细胞;CD56-NK细胞; CyclinD1-套细胞;TdT-淋巴母细胞； Ki67-Burkitt淋巴瘤等。
7 R4 y4 Q' h+ g) [' R+ Z+ u      4）肿瘤标志物水平与肿瘤体积大小、临床分期相关，用以判断预后 PSA水平可辅助前列腺癌诊断分期；在卵巢上皮癌组织HER-2 过表达对患者具有预后价值[5]。
! _; P2 O! D# B2 Q6 l      5）可反映肿瘤的动态变化，监测治疗效果、复发和转移 在肿瘤治疗前、中、后检测肿瘤标志物的水平可帮助了解治疗效果，监测肿瘤有无复发和转移，如CEA对大肠癌、AFP对肝癌、HCG对绒毛膜癌的监测、CA125监测上皮性卵巢癌。
- O0 A, x, `- ~7 O2 J1 G      6）可为临床选择化疗药提供依据[7] 化疗失败的主要原因是肿瘤产生了耐药性。肿瘤产生耐药性与多种因素有关，如多药耐药基因(MDR1)、谷胱甘肽-Ｓ-转移酶(GST-π)、拓扑异构酶II(TOPOII)等。其中最重要的是MDR1表达增高及其编码产物的ｐ-糖蛋白(P-gp)增多。许多肿瘤在化疗前即有MDR1表达增高，在化疗后比例更高。 ' o# ~$ E' ^% X- S: z: H( M
      克服肿瘤化疗耐药的策略：根据检测MDR1、P-gp、TOPOII、GST-π结果选择非耐药类的化疗药；采用耐药逆转剂，疗效较为满意的代表药物有异博定、环孢素、利血平、酚噻嗪等。 ( b3 X( R8 Z5 I
      7）可为临床提供靶向治疗依据 90％的B细胞淋巴瘤表达CD20抗原。1997年美国FDA通过用于临床的第1个单抗-Rituximab（美罗华）。它的抗瘤机制是通过抗体依赖性细胞毒作用和补体介导的细胞毒作用杀伤CD20阳性B淋巴细胞。 2001年，由法国、比利时、瑞士的86个中心完成的临床试验，比较美罗华与CHOP化疗联合使用与单一CHOP化疗治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，结果联合组完全缓解（CR）率明显提高（76％ 对 63％，P=0.005）而且不显著增加临床毒性。美罗华与IL-12联合的II期试验43例成人B细胞淋巴瘤，结果显示69％的患者达到CR或部分缓解（PR）。 6 q. e3 q3 A0 `
FDA推荐在每例原发性乳腺癌和转移病灶中检测ER和PR，无论是绝经期前后，还是辅助治疗或姑息性治疗，激素受体状况决定患者是否从内分泌治疗中获益。
+ @& N' I! ]' y: a% t      FDA批准使用荧光原位杂交法检测C-erbB-2/ HER-2基因。25％～30％的乳腺癌患者HER-2呈过度表达，1998年FDA通过第2个用于临床的单抗-Trastuzumab (Herceptin 赫赛汀）。赫赛汀治疗HER-2过表达的乳腺癌患者，HER-2过表达的水平越高疗效越好[11]。469例化疗与赫赛汀联用和单用化疗在HER-2阳性转移性乳腺癌患者表明联用能显著提高疗效，延长中位生存期。 * e$ A) U. [+ `
      bcr-abl融合基因及其蛋白产物是慢性髓细胞性白血病（CML）慢性期发病的单一原因，而STI571（Gleevec）可特异性地抑制bcr-abl酪氨酸激酶，彻底切断异常酪氨酸激酶的信号传导，从而达到抗肿瘤作用。目前STI571经FDA批准，用于治疗干扰素治疗失败的CML慢性期、危象期以及加速期。用STI571治疗了54例干扰素治疗失败的CML慢性期患者，完全血液学反应率为98％（53/54），54％的患者产生细胞遗传学反应（29/54），其中13％的患者达到完全细胞遗传学缓解（7/54）。
* ~. X, q/ Q  F; k, L      STI571在治疗48例复发或难治性Ph（＋）的急性淋巴细胞性白血病完全血液学缓解率19％，完全骨髓缓解率10％。
8 W5 T: [9 V& I9 J7 g! t6 ^/ s5 n& A0 M+ g- ^
临床应用
) h/ g" X( e0 v! V9 L' ]      由于各标志物有组织特异性，在同一肿瘤可以出现几种肿瘤标志物，又可在不同肿瘤出现同一种肿瘤标志物，因此提出了多种标志物联合监测的必要性。根据不同肿瘤和不同肿瘤标志物的特性，适时、适当选择特定肿瘤标志物非常重要。目前不少肿瘤标志物的临床价值尚不确定，并缺乏标准化的试剂、质控标准和测定方法。不经选择就进行多种标志物联合检测达不到提高检测效率，还会增加检测成本。肿瘤标志物并非联合越多越好，应以最少的联合达到最佳的效果，选择出常见肿瘤的最佳标志物组合。 5 M- R9 g' W$ r, F
（1）肺 癌 ' ~% z. n: }7 O6 ^/ H
      CEA对肺腺癌较为敏感并且其阳性率随病程发展而增高。
: o' e: n7 ]- T- ?  L" z      SCC和Cyfra21-1对肺鳞癌敏感。
, D# ?5 ^3 o3 u2 c1 ~      NSE是小细胞肺癌的良好标志物。
  s+ g3 x+ [2 W1 _! h      血清CA125水平高于70μg/L的肺癌患者均属于晚期。组织多肽抗原(TPA)和Cyfra21-1水平增高提示晚期肺癌。 6 w& r5 P3 G9 e3 s; O( j6 {
      GST-π在鳞癌和腺癌中表达阳性率分别为94%和70%，但在小细胞肺癌中表达很低。GST-π和NSE可作为不同病理类型肺癌鉴别诊断的重要检测指标[2]。 2 [) t, n3 l1 Z# w
      在肺原发性肿瘤中,良性者ｐ16表达89%以上,随着癌组织分化程度的降低ｐ16的表达也降低，特别是小细胞癌最低，故ｐ16可提示肿瘤细胞的增殖活性并可预报预后[19]。 5 H6 c* f; B7 I1 A$ i8 |+ ]7 [
（2）鼻咽癌
" S3 j0 u# V; n. w$ \      SCC和Cyfra21-1对鼻咽鳞癌敏感。 8 O' b5 m% R' y) e6 Y0 Y4 E, S7 V
      CEA对鼻咽腺癌较为敏感。
1 t3 c- b5 L3 Z$ [8 X      DR70蛋白对鼻咽癌的敏感性为84.8%，可与EBV IgA /VCA联合应用,提高鼻咽癌诊断水平。 ( D# z" l& Y6 o8 J# ?% P4 u
（3）原发性肝癌
- S* g* q+ ]# ^2 @% R      AFP是原发性肝癌的首选标志物，但仍有25％～35％的原发性肝癌患者血清AFP呈阴性或低浓度阳性。如AFP、AFP异质体与B超检查结合，可在症状出现前6～12个月作出诊断，使小肝癌诊断率提高到97．5%。AFP、AFP异质体也是反映病情变化和治疗效果的敏感指标，有助于检出亚临床期复发与转移[2，10]。肝癌CA19-9 阳性率为64.6%。此外，γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和脱-γ-羟基凝血酶原（DCP）等有较好的诊断价值，其中以γ-GT和GSTs敏感性和特异性最佳，对于小肝癌及AFP阴性肝癌诊断有重要意义。 + y: W3 l9 S- [5 h
（4）食管癌
6 X" I/ ^$ P2 i) a, T) b      SCC和Cyfra21-1对食管鳞癌敏感。食管癌患者外周血中CD44%升高可提示肿瘤复发或属于晚期病人。
. Q7 _3 e) X% O6 s- H（5）胃癌
, i/ i( x' w8 y% \+ x' K      CEA、CA72-4、CA19-9是较好的联合检测胃癌指标，可显著提高胃癌诊断的阳性率，有助于观察疗效和发现复发。 ( ^8 m( x, g8 o' M6 V$ D$ ?9 d+ [
      日本利用ＰＧI、ＰＧII进行人群普查，使胃癌的早诊率提高到了90%。ＰＧI/ＰＧII比值降低是胃癌和胃腺瘤的高危信号。
; L1 e4 ^' l2 D6 {2 J      在胃癌组织中Ｈ-ras（ｐ21）过表达和淋巴结转移状态密切相关。
$ P/ r# A, d% B      胃癌患者外周血中CD44百分比升高与肿瘤发生部位、肿瘤大体类型、肿瘤大小、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况、临床分期、年龄均有相关性[24]。 4 e% u( r/ n, S7 ~9 @1 b
（6）结、直肠癌
" K$ A' R& S8 b" X      CEA和CA24-2联合检测是最佳标志物组合，可显著提高诊断结直肠癌的敏感性和准确性。也可用于结、直肠癌术后疗效评价、病情分期和复发监测。血清CEA水平变化与结肠癌Duke分期密切相关。当发生肝转移时，CEA升高更为明显。 ( q. M1 V5 _8 \6 \1 x" Y4 Z
      美国推荐在结直肠癌术前CEA检测有助于分期和制定治疗计划。但不应以CEA指标确定是否进行辅助化疗。推荐术后2年或2年以上每2～3个月检查1次血清CEA，若CEA升高，有必要进一步检查转移灶，但不推荐单用CEA作为常规疗效监测指标。p53和ras也不作为筛选、诊断、分期和疗效监控指标。
& T; c5 t3 Q* B- \/ `0 C: _      肠癌患者外周血中CD44百分比升高与肿瘤发生部位、肿瘤大体类型、肿瘤大小、肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期、性别、年龄均有相关性。
, p- T* ?- ?9 |- f3 e- k) B# g（7）胰腺癌
5 \2 L5 h: W1 z# s, I% D      CA19-9对胰腺癌的敏感性达80%，血清中含量的高低提示手术的难易程度，CA19-9低者预后较好；肿瘤复发时，CA19-9可再度升高。如果联合CA 24-2、CEA则可把诊断率提到90%以上。CA125、CA50在胰腺癌也有一定的敏感性。 " e1 j" I& Y5 ~7 }8 @7 q
（8）乳腺癌
5 f2 y9 V8 r) ?' l6 h  i+ J8 m      FDA推荐监测ER、PR和HER-2基因，为临床提供治疗依据。
3 O+ W: m6 {( T7 k( i. e  U      CA15-3对早期（I、II期）乳腺癌阳性率较低。有研究显示CA15-3升高较临床症状及其他试验提前5.3个月提示乳腺癌复发。   J5 u1 A) u" a. m* a. X
      CEA对乳腺癌早期阶段敏感性较高。CA15-3、CEA、Cyfra21-1联合检测有助于提高乳腺癌诊断和病情监测的敏感性和特异性。但FDA不推荐作为乳腺癌筛选、诊断、分期和常规疗效监测检查，在缺乏可测量病灶时，CEA升高提示治疗失败。在乳腺癌中检测p53和组织蛋白酶D无临床意义。 % J5 M+ N: ~, ?5 Q3 H2 L: {& L
      有报道检测乳腺癌组织中的Ｐ-ｇｐ表达与否，对病人的预后判断、治疗方案的选择以及联合应用ＭＤＲ逆转剂有积极的意义。
3 x5 b$ V3 s. x" m( {: y（9）卵巢癌
  {+ c# b5 U" E+ Q# f% K7 A% S; v      CA125是卵巢癌上皮癌的首选标志物[6]，但主要在卵巢浆液性癌及未分化癌中的阳性率比较高,而在粘液性癌中则阳性率比较低。ＣＡ125的升高较临床上能检查到肿瘤要早3～6个月。CA125和CA19-9联合检测提高了卵巢癌诊断的敏感性（91.6％）。CA 125对卵巢癌的疗效和复发监测也有重要价值。应于术后第6天开始测定CA 125，然后依照其半衰期随查，CA 125半衰期若≤25天,经过减瘤术后化疗达到病理完全缓解(CR)的机率较半衰期＞25天的高3.585倍,半衰期长者显示预后差，应给予加强治疗。如果CA 125不能恢复到正常范围，应考虑到有残留肿瘤的可能性。卵巢癌治疗后的1年中，应每3个月检测1次CA 125，1年后每6个月测定1次。
6 c% B0 d. @5 Z5 X3 A) Z      CA125与CA72-4联合检测，两者均阳性时特异性为100%，两者均阴性时，说明无残余肿瘤。 3 a; W( f& e4 t& x4 i
      AFP是生殖腺内、外胚胎性肿瘤的首选标志物。AFP升高提示肿瘤组织中存在有内胚瘤成分，卵巢内胚窦瘤中特异性AFP升高，可用于诊断、疗效观察和预后判断。 1 [3 }+ u: @' T+ V$ ]+ U+ l
      β-HCG检测有利于绒毛膜癌进行临床分期、疗效观察和预后判断。 ( k) Q! P9 T* x* n1 [% s: G
（10）宫颈癌、宫内膜癌 3 C( R0 H& |+ Z6 ^  z
      SCC和Cyfra21-1对宫颈鳞癌敏感。 * R% v- w! R+ c7 f4 h2 t  d4 \  ?
      CEA对宫颈腺癌、宫内膜腺癌较为敏感。
% @2 V3 `: d1 x8 ~3 N5 m2 \4 q      ER和PR可作为宫内膜癌常规检测内容并指导内分泌治疗。 & m7 d; G# q0 ?% X7 w( s
      检测HPV可辅助诊断宫颈癌。
1 H; @2 ?' V; ]0 n（11）前列腺癌
9 L4 M) b( _9 y2 d/ N: f& M      PSA是诊断前列腺癌最敏感的指标，血清PSA水平与前列腺癌肿瘤体积成一定比例关系，PSA水平越高，病情越重，预后较差。
5 q4 G  L0 |- H1 o& b7 f      f-PSA和总PSA（t-PSA）的联合应用，采用f/t比值可以明显提高诊断的敏感性，可作为良、恶性的鉴别指标。6 X3 L  S* T+ ]( I9 F
（12）睾丸癌 + x% P: ~" J/ y% V
      血清AFP和β-HCG可进行临床分期、疗效观察和预后判断[10]。 * b1 [# e  [9 x  ~1 S
（13）膀胱癌
) f! C5 N& H+ q1 D      NMP22已由ＦＤＡ批准用于膀胱癌患者监测。但良性泌尿生殖系统疾病的假阳性率很高。
" \  u* U" h# r5 q) X      检测尿中ＵＢＣ也是ＦＤＡ批准用于监测膀胱移行细胞癌。
  \, V+ L3 J: s& I6 u0 A      Cyfra21-1用4ng/ml标准，其对膀胱癌检出的敏感性可达96%，特异性可达74%。不仅对诊断，还可作为随访，预测复发。
8 w9 t4 w. X$ ]" a4 B$ C- Q      FCM检测尿液，膀胱冲洗液DNA可预测患者治疗后肿瘤复发可能性。
$ R4 ], ]7 [' R0 U- K- Y2 j2 L（14）白血病和淋巴瘤
/ t9 x, m8 @8 u1 v7 x) \      T细胞来源：CD2、CD3 (CD4、CD8 ) 、CD5、CD7 4 i: r( K" r9 `
      B细胞来源：CD19、CD20、CD22 ; W1 M& @% z2 z4 A( w
      造血干细胞：CD34
( |! x# S1 `6 }4 m% n4 m      各期髓细胞：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）
7 s& `0 A) O2 x4 h, |      红白血病：GlyA（血型糖蛋白A） , c; }& Z/ l3 ^6 N& y* P: C3 J" b( B
      巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61 8 ~3 x4 n4 a  x
      霍奇金病：CD15、CD30
2 X; G2 A; M7 D+ x8 C2 X      Ph1、bcr-abl融合基因检测有利于靶向治疗。 & i! c% u, \1 q1 |+ c
      FCM动态观察白血病化疗前后DNA可发现微小残留病变。
+ F4 j; i) M5 n( X2 e4 j: D$ |3 ^/ X; [* B
多种TM的联合检测及临床应用
: |4 L) K3 P! H) t, p$ j      一般肿瘤治疗后4-8周，如果TM的浓度明显降低至正常水平，则表明肿瘤已基本消除；如果浓度降低很少，甚至不降低，则表明肿瘤还在增生或治疗后复发，也可能发生转移。目前单一标志物的检测灵敏度及特异性尚难满足临床对早期诊断、疗效及预后评估的要求，故多采用联合检测的方法。3 q" w/ w: |5 `( T
遗传标志物检测的临床应用 3 |6 }$ h  u0 @' X/ z; o, c
      遗传标志物（基因肿瘤标志物）：在正常细胞转化成恶性细胞的整个演变过程，均涉及到癌基因及相关基因的活化、抑癌基因的失活以及某些染色体片段的丢失。

基因诊断原理

( T  @; ~5 z9 t1 u; t
$ }9 s3 D. h( v# h# z       基因诊断(gene diagnosis)又称DNA诊断，是利用DNA重组技术，直接从DNA水平来检测人类疾病的新的诊断手段，是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。是继形态学、生物化学和免疫这诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生和发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。基因是遗传的物质基础，它决定了病原体的生物学特性。除个别病毒外，现知的所有微生物均是以核酸为遗传物质。病原体的基因既可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。基因是决定遗传性状的最基本的功能单位，生物体的完整结构(细胞器、膜结构等)的保证及各种功能的发挥有赖于多种基因的正常表达及相互调节，这些基因构成了一个生物体的完整的基因组。简单病原体的基因组，如某些病毒仅由一至数个基因组成，细菌的基因组则含有数千种基因。但是任何一种病原体均有其独一无二的基因组成和结构，尤其是基因的一级结构，这就为病原体的基因诊断奠定了物质基础。基因诊断的目的就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存在。
* c* G' T- I; f# b) w/ T# ^5 W, u　　1．传统诊断方法的缺陷6 P) r+ c) k: X8 v6 `6 k
　　传统的疾病诊断方法大多为“表型诊断”，以疾病或病原体的表型为依据。而表型的改变在多数情况下是非特异的，出现的时间也较晚，易错过治疗的最佳时期。某些疾病本身不呈现显著的表型改变，用传统的检测方法易出现“假阴性”。另外，传统诊断方法费时，精确度低。, I8 O1 a3 i7 F( e  t7 X! R) O% X
       2．基因诊断的优点   
6 }/ g) {& N4 O+ F( y9 v% `　　基因诊断以基因作为检测对象，因而具有以下优点:
' F' ?8 |* {$ {       （1）针对性强，特异性高。
6 f7 s, o1 S& [$ h       （2）标本用量少，来源广，灵敏度高。病人的血液、尿液和羊水脱落细胞以及头发等均可用以检测，由于基因体外扩增技术的发展，待分析的标本只需微量，目的基因只需pg水平。
5 W( C6 V  }" {1 S% l( H# C       （3）适应性强，检测范围广。
* m0 v9 t5 _: J' o% h       由于基因探针的来源种类较广，其探针序列可为已知亦可为一类特定的基因组，可为内源性基因亦可为外源性基因，在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体，能确定以往感染，也能确定现行感染。对那些不容易体外培养和不能在实验室安全培养的病原体，也可用基因诊断检测，辅以DNA片段长度多态性分析，还可以对病原体进行基因分型。另外，基因诊断可用于研究基因差异表达，对有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测;还能对疾病的易感性、发病类型和阶段以及疾病的抗药性作出判断
" U' ?: v- T6 c  A+ m5 T+ m# w! o  s8 b
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基因诊断技术方法分类

1 s/ S1 [* B! i# Q8 B+ [+ J$ a（1）诊断技术分类( S; M. v; Y, z
       1)根据目的基因是否被放大分类  可分为杂交法和扩增法。前者被检测的目的基因不被放大，如分支链DNA技术，但用杂交法可以进一步检测经过放大了的基因片段，如PCR产物杂交分析；后者包括PCR及连接酶链反应，Qβ复制酶系统等。
  W$ A/ f3 R1 d* v# |+ E+ r- E       2)根据被测基因的核酸类型分类  ①在杂交法中，Southern印迹用于检测DNA；Northern印迹用于检测RNA；斑点印迹或称斑点杂交，既可检测DNA也可检测RNA。②PCR法主要用来直接扩增DNA，但是通过逆转录技术，可以将RNA先转变为cDNA再行扩增，称逆转录PCR，如检测HCV、HGV、HIV等。③原位杂交，或原位PCR，也可分DNA或RNA原位杂交和原位PCR或原位逆转录PCR。
$ e- A* R/ O& N" l* Z       3)根据是否提高了敏感度分类  分支链DNA技术(bDNA)，就是根据固相杂交的原理，采用了一种放大标记探针，目的探针不被放大，但检测信号被放大，从而提高了敏感度；套式或巢式PCR，是用两套引物(内、外引物)作两轮PCR，第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作为模板，敏感度进一步提高，常用于极微量病毒基因检测，如检测TT病毒，以及检测大多数RNA病毒(称逆转录套式PCR)。& z& |. G3 g7 h
       4)根据待测标本的性质  分体液(血、尿、粪、痰液、胸腹水等等)、细胞和组织基因检测。①体液中的待测基因可在将标本适当处理后，根据需要采用上述各种方法检测；②组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法；③细胞内病原体基因检测可以通过细胞裂解，释放了待测基因后，采用与体液检测相同的方法，也可将细胞固定于一定载体上，如玻片，或硝酸纤维膜上(如平板上细菌菌落内的基因鉴定)，采用类似于组织基因测定的方法。- ^- g6 s" t, h% t7 _
       5)根据诊断目的或要求  分为定性诊断、定量诊断和半定量诊断，以及序列分析等。$ H6 b. \1 Y1 Z& ?9 Z" d8 K
（2）基因诊断的策略/ s6 {3 @; @/ O
       1从基因产物入手  这是一种比较早期的诊断策略。首先分析异常基因的产物（蛋白质），并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质以后，进行氨基酸序列测定，据此合成寡核苷酸探针，从互补DNA（cDNA）文库或基因组文库中筛选克隆，然后通过DNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA，由表型至基因型。迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病、苯丙酮尿症（PKU）和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离的。
+ Z- q' @/ Q1 D/ }, _3 |! [! N/ I       2从基因定位入手 根据遗传连锁图将致病基因定位在染色体的某一具体位置上，这种基因定位和克隆的策略称为定位克隆。比较正常和异常基因的差别，就可找出导致遗传病的分子缺陷，进而阐明正常和异常基因产物（蛋白质）的生理功能和病理效应。常用于染色体上基因定位的遗传标记有限制片段长度多态性（RFLP）、可变数目串联重复序列（VTR）、短串联重复序列（S