细胞因子检测方法分类3 Y( E) G* x o( l/ ^; f
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（1） 分子生物学测定法
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这种方法是测定细胞因子mRNA的表达水平。由于细胞因子mRNA半衰期短和拷贝数少，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法，因其灵敏性高和操作简便，比Northern印迹法和原位杂交法更有临床应用前景。
! V. f$ r# ]' `: ~" c* L RT-PCR法的扩增技术日臻成熟，目前的主要问题是如何防止假阳性和如何方便定量。假阳性困扰所有PCR操作，这个问题的克服有赖于对操作环境和操作规程的规范及严格限制，有赖于简化及合并操作流程，提倡单管中密闭操作，测定荧光强度代替电泳图像定量法。PCR的定量首先要解决标准化的对照模板，对照模板在逆转录和扩增上与细胞因子的天然模板相同，但扩增产物有所差异，定量时容易鉴别区分。国外一些实验室和公司已制备出若干细胞因子的竞争性mRNA模板，这种模板两端具有与欲测细胞因子引物互补的序列，而模板的中间部分比该细胞因子正常mRNA略短或略长。随着PCR技术的发展和完善，随着细胞因子引物和对照模板的标准化，细胞因子的分子生物学测定方法将会用于临床。
9 |. t3 H; b1 w7 S（2） 生物活性检测法
9 a+ ]. {% \8 }4 b2 G 这种方法是检测细胞因子的生物学活性，特异的生物活性和免疫化学特性，是鉴别细胞因子的重要指标；并且，独特的生物活性往往是细胞因子被发现的先导。当然，鉴于细胞因子活性有普遍的重叠性，以生物活性命名造成混乱，现在生物活性在细胞因子的认定上，已降为次要指标，一种新细胞因子的鉴定主要依据其有独特基因结构。尽管如此，由于生物活性测定法提供的是生物功能信息，故本法依然是一种基本的和必需的测定法。
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本法是基于测定细胞因子的生物活性，诸如其刺激细胞增殖活性、其维持细胞生长和存活活性、其抑制细胞生长活性、其溶解或杀灭细胞活性、其抗病毒活性、其促进细胞趋化活性、其刺激细胞生成集落活性等等。生物活性的指示细胞多选用造血系统或淋巴系统细胞，显示细胞反应最多的是，用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。指示细胞可为原代细胞，最好用细胞株，尤其依赖性细胞株细胞。原代细胞不均一，尤其当用人的原代细胞时难免个体差异，数人混合可减少这种影响。细胞因子依赖细胞株细胞的生长和增殖敏感性主要依赖于某一种细胞因子，而对其他细胞因子不反应或反应性极低。细胞因子依赖细胞株的选择和使用可参照文献进行。依赖性细胞株细胞不仅均一，而且在特异性灵敏性方面也明显优于原代细胞和非依赖株细胞。但依赖株细胞的特异性并非绝对，特异性差就成为生物活性测定法普遍的缺点。
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细胞因子的受体亲和性高，细胞因子浓度10-10～10-15 mol/L时就可显示生物作用，所以其测定的灵敏度高，一般在免疫化学测定法之上。测定范围在10～100倍，信号与噪音比≥5。生物活性测定法测定的是有生物活性的细胞因子，前体分子、降解片断、与结合蛋白或可溶性受体结合的细胞因子、细胞因子聚合物均不能用此法测定；细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和一些病毒编码的类细胞因子，也能干扰测定。检验样品中是否有干扰，可将被测样品稀释，作样品剂量-反应曲线，看其是否与细胞因子标准品的剂量-反应曲线平行。
5 Y! z7 l# z0 s 生物活性测定法的缺点是，除需维持靶细胞株，操作繁杂和难定量外，特异性差是最主要缺点。生物学检测法一般敏感性较高，直接表示待测标本中的活性水平。但实验周期较长，如集落形成法需10～14；易受细胞培养中某些因素的影响，如血清、pH、药物；易受生物学活性相同或相近的其它细胞因子的影响，如检测IL-2时可受IL-4的干扰，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表现出极为相似的生物学作用；易受待栓样品中某些细胞因子抑制物的干扰，如IL-1活性可被IL-1受体拮抗物（IL-1ra）所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻断；不能区分某些细胞因子的型和亚型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亚型显示相同的生物学活性；某些指示细胞长期培养易发生突变；不同指示细胞对同一种细胞因子的敏感性不同，所慕名而来结果难于标准化；此外，某些人源的细胞因子如hIL-2对小鼠细胞起作用，但鼠源性的IL-2对人的细胞则无刺激作用。除依赖细胞株的原因外，由于细胞因子受体有共有链，也引起细胞因子活性有交叉性，如白细胞介素（IL）-1和肿瘤坏死因子（TNF）-α；IL-4与IL-5和IL-7，IL-3与粒细胞单核细胞-集落刺激因子（GM-CSF）等。降低这种干扰的方法是，在测定样品中加入抗干扰性细胞因子的中和抗体，中和起干扰的细胞因子活性。
+ f( n$ V/ V8 |3 [3 \' o7 Q 生物活性测定法大致可分为增殖或增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击、趋化作用以及抗体形成法等几类。
$ E6 R% B9 O0 H3 E 1） 增殖或增殖抑制法
1 ]& [& K( ~" [ 其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过3H-TbR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。
`. K+ b$ ?# ^, H# ?- E1 t 2） 集落形成法
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其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。
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3） 直接杀伤靶细胞
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在细胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以及WEHI164亚克隆13作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。
6 R' X, c1 h: l$ l+ S8 @: C" U2 U' M 4） 保护靶细胞免受病毒的攻击
+ L5 ^+ {# }5 n# ~% N3 ] 靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击，常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）,敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。
' }: T! u+ ?! w/ H7 W 5） 趋化作用
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IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。
: |" E. ]8 f1 o 6） 抗体形成法
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IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白，常用的指示细胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。
7 q$ Z5 A* w: e/ M" D" D- Q \8 c. O（3） 免疫化学测定法
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这种方法是检测细胞因子蛋白质的抗原特性。免疫学检测法本法利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如IFN），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的McAb只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。
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生物素、亲和素放大系统引入酶标测定系统后，大大提高了酶联免疫吸附测定（ELISA）法的灵敏度。若灵敏度选在高于本底信号2～3个标准差，目前多数细胞因子的ELISA试剂盒可测至5～10 ng/L，已接近生理浓度，也达到放免法的灵敏水平，因此，目前国外公司推出的细胞因子检测试剂盒，绝大多数都是采用ELISA法。
3 t I: j$ e# M4 uELISA法的优点是特异、方便、易标准化和批量化，很适合临床应用。其缺点为提供的是免疫活性信息而不是细胞因子生物活性信息。细胞因子前体分子、细胞因子分解片断、细胞因子聚合物、细胞因子与结合蛋白或可溶性受体结合物、虽均无生物活性，但依然可为免疫化学法测定。除此之外，血清或体液中的嗜异性抗体、抗类风湿因子等自身抗体也能干扰测定结果。
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检测细胞因子时绝大多数ELISA法使用以下3种策略：
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1．间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。
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2．夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。
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3．竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。
" m* J# i( U$ v* X$ x; b. { 除了以上3种，直接法用于检测抗原或抗体（特别是总抗体浓度）方法已经不常用。实验中选用何种形式取决于实验的目的，特别是待检测标本的类型。
% J7 ^$ g" A6 O （1）ELISA（或RIA）夹心法
7 F E. C. U9 b/ F3 }( K K% I 根据抗体性质和特异性不同可有以下几种不同的夹心法ILISA。
1 ]. Y8 ^$ i& I# T1 @ 1） PcAb与McAb夹心法
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用纯化的多克隆抗体（PcAb）包被板子，加待检细胞因子（或可溶性受体）和标准品，上层加酶标记的McAb。有时为了增加敏感性，上层加McAb后再用酶标记第二抗体显色。
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2） McAb与PcAb夹心法
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用McAb包被板子，加待检样品，上层加酶标记的PcAb。有时为了增加敏感性，上层加PcAb后再用钊对PcAb的酶标记抗抗体。
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3） 双McAb夹心法
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选择和应用识别同一个细胞因子（或受体）分子上不同表位的两种McAb，其中一种包被板子，另一种McAb标记酶。由于单克隆抗体亲和力识别表位地匀一，从质量控制角度来看，一般比上两种夹心法易控制。如目前已商品化检测细胞因子（或其受体）的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。
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4） 细胞、McAb夹心法
" c0 z" K. N$ V. ?$ y- A2 M/ a 用表达IL-2R的MT-1细胞包被板子，加入待检IL-2或标准品，上层加125I标记的McAb，根据γ计数cpm值推算出待检IL-2含量。
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特异性检测可溶性细胞因子或趋化因子一般采用夹心ELISA技术，细胞因子夹心ELISA的实验方法是用高纯度的抗细胞因子的抗体（捕获抗体）非共价吸附在塑料微孔板上。板子经过洗涤后，固定的抗体可特异性捕获样本中存在的可溶性细胞因子蛋白。洗涤未结合的物质，通过加生物素联接的抗细胞因子抗体（检测抗体）来检测被捕获的细胞因子，然后再加酶标记的亲合素或链亲合素。最后加显色底物溶液，显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical density）记录。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果
' m, R7 H. J7 E 夹心ELISA法要有抗同一细胞因子不同表位的两个抗体。一个抗体用于包被作捕捉抗体用；另一个抗体分子作检测用，其分子上标记生物素。生物素分子与标记酶的亲和素分子结合。一般用单抗作包被抗体，用多抗或几个单抗混合起来作检测抗体，这样可以提高检测的灵敏度。
) r( U& ]9 e: k* K- u 为了增加敏感性，在上述系统中可再连接上生物素，再用链霉亲和素（streptavidin）酶标记物进行放大。此外，还可用化学发光、改进显色底物等措施提高检测方法的敏感性。
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用ELISA检测细胞因子时，首先要弄清所测细胞因子的性质和其存在形式与部位，正确解决标本选择、标本收集时间、污染防止和减少干扰等问题，才能获得满意结果。体内多数细胞因子在生理情况下，血中浓度极低，不宜用血标本测定。但一些经常性分泌的细胞因子，如红细胞生成素（EPO），粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等，或某种病理情况下能引起其分泌亢进的细胞因子，可用血浆或血清直接检测。在某些病理情况下，一些细胞因子参与局部病变，这类细胞因子往往在局部体液中浓度升高，这种体液也可选为检测标本。细胞培养上清液是测定体外刺激培养细胞的细胞因子常用的标本。但收集上清液的时间，应考虑细胞因子分泌的动力学。
0 f5 g( o+ c1 E2 D( J 任何给定时点的细胞因子浓度，都是分泌和消耗及分解的总和，都是这一时点的瞬时结果。不同的细胞因子的分泌峰时不同。此外，产生细胞、活化剂种类、培养条件等不仅会影响分泌细胞因子的种类和分泌量，而且会影响峰值出现的迟早，为了获得稳定的结果，应严格控制。各种标本中一旦有细菌和其他微生物污染，在操作过程中就会引入新的干扰。当血液样品中受污染，内毒素含量达到10μg/L时，在37℃下放6小时就会显著分泌IL-1、TNFα、IL-6和IL-8，而这种污染程度肉眼尚难观察。有实验表明，肝素抗凝样品易受污染影响，其次是枸橼酸抗凝，而乙二胺四乙酸抗凝受污染影响最轻。此外，取样品后立即转入4℃保存也是降低污染影响的有效措施。
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（2）竞争法
/ r' B! r, g9 Y7 `4 w1 ^8 t! c 有报道用况争法检测IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同时加入125I标记的IL-2和待测IL-2，根据γ计数cpm值得知待检IL-2对125I-IL-2与PcAb竞争结合的程度，从而推算出待测标本IL-2的含量。这种方法检测IL-2的敏感性可达50pg/ml。
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