Western Blot

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主要内容：$ ^2 o6 z* i. x
1.Western Blot原理( z& `: F( T9 X; A+ o+ Q
2.Western Blot试剂的准备) S9 `) Z$ f. Y, J5 D, c
3.Western Blot 实验过程
3 M" u/ m+ d* G0 p! L4.Western Blot 应用
3 i' `2 {  j0 z1 u& v, \; F' n6 Z5.Western Blot 常见问题分析& e" J4 v3 v# u# i' S
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4 I& ^$ _3 Y# ?( ?( @4 k整理者：phyllis  审改者：nano  db. S; t  n! N' R, }9 [
主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》) I' ~/ P) @& i6 R5 Z0 H

/ J0 {. N# [! H, r- w$ Q* Z7 L[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:45 编辑 ]

Western Blot原理

5 A) \1 U/ z3 Y! o$ y( k　　Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。6 Y1 X  p3 i: W8 H
　　推荐书籍：《分子克隆》、《抗体技术实验指南》、Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）、《蛋白电泳实验技术》、《蛋白质技术手册》等。
6 U! r: L+ @! [; f原理4 D9 ~6 R# {" m% @
　　与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:46 编辑 ]

Western Blot 应用

) l2 G  Q( I' O. Y6 y  `1. 可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位）的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量分析小分子抗原 。
4 A6 r( s- h& |) c$ ~& H; @1 E2. 表位作图  }5 T) }1 c4 o0 g
3. 结构域分析
9 ~: {" k9 ~1 M* a3 n/ }4. 斑点印迹，可用层析组分，蔗糖梯度或脉冲追踪实验分析
% L% `" ]! Q7 e, F. t- A2 y5. 功能实验中蛋白质复性
; D: Z& U6 s4 B2 `4 t+ _6. 配基结合，免疫印迹后多种配基可同蛋白质进行配基结合试验。: ?  }7 p/ q% I/ g$ c% T5 z4 y
7. 抗体纯化% V( r8 M" e0 p: F- I, F
8. 有膜上收获蛋白质条带制备抗体
; F" I5 V  r6 |+ g, o  L9. 氨基酸组成分析和序列分析，极微量蛋白质（10pmol）转移到PVDF膜上或可进行氨基酸组成分析和序列分析。转移的蛋白质或多肽条带可经考马斯亮蓝染色后切下进行氨基酸组成分析或序列分析。

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# A- |0 m% ?9 p! G( D[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:46 编辑 ]

3楼中　　14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用R-250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）2 ?/ i0 k1 U: [
定量是G250

谢谢关注和指教！
* p, |4 h5 E. x已经修改

我们实验室通常用R350染色，但脱色时间较长。用G250染色也可以，但染的时间较长，无须脱色，背景清晰

谢谢分享经验！