新型联合疫苗的开发
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( r; x% w3 ~. I' Y( Y/ h       CVI的最终目标是接种1剂疫苗即可预防多种儿童传染病，即将现有的多种单价疫苗改进为具有相同保护效果的多价联合疫苗。预防接种的途径可以是注射、口服或皮上划痕。目前在研究开发以DPT为基础的新型联合疫苗，以活疫苗为载体的联合疫苗和口服联合疫苗。研制联合疫苗首先要解决的是稳定性问题，要达到2年以上的保存期。联合疫苗中各组分间的化学和物理作用可影响疫苗的免疫应答。其他成分如佐剂、缓冲剂、贮存剂和赋型剂等通常需要重新配伍。多价联合疫苗中这些问题通常较易解决，因疫苗中含有相同性质的成分，如多糖或同属灭活病毒，其中1个组分的稳定性配方通常适用于其他组分，但也需要对每1个组分做专门试验，以保证成品的理化配伍性和稳定性。活病毒间可相互干扰，如1个病毒可因激活免疫应答而产生干扰素从而抑制另1个病毒。3 B. Z5 F6 L8 L
       最近几年美国准许使用的联合疫苗包括白喉、破伤风类毒素、无细胞百日咳疫苗（DTaP），由于它可减少副作用发生和高效性，ACIP推荐DTaP作为常规百日咳疫苗；DTP-b型流感杆菌疫苗（DTP-Hib）；b型流感杆菌苗-乙型肝炎疫苗（Hib-HepB）；甲型肝炎-乙型肝炎疫苗（HepA-HepB）。还有一些正在开发的疫苗有待进一步验证。下面就一些常见的联合疫苗分别作一些分析。
0 ]( @: W4 r, L7 A' x  \/ j1. 疾病联合疫苗
8 g1 c+ W0 g' p7 V) d: }3 y$ n　　1.1DTP-Hib联合疫苗- p$ D& O) l( C. n+ ^/ Z
　　当前DTP-Hib疫苗在许多国家允许使用.多数研究发现,联合疫苗中的各成分之间免疫原性不受影响,但也有不少数研究表明注射DTP-Hib疫苗后,婴儿抗Hib荚膜多糖聚核糖基核糖醇磷盐(PRP)抗体滴度明显降低,机制尚不清楚.在DTaP-Hib疫苗的研究中也发现了类似情况.接种DTaP-PRP-T(载体蛋白为破伤风类毒素)疫苗的婴儿在初次免疫后对PRP出现低水平的抗体应答,但这些婴儿用PRP-T加强免疫后超过97%婴儿抗体滴度显著增高,可达1.0μg/ml以上.欧洲在1996年批准使用权DTaP-Hib(PRP-T)-脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV),目前DTaP-Hib(PRP-T)-IPV-HepB在欧洲也获准使用。
4 D2 Y# E7 C) U　　1.2DTP-HepB联合疫苗。7 U* V9 u( g( K  m8 B8 U
　　DTP-HepB或DtaP-HepB联合疫苗对婴儿安全有效，欧洲已准许使用，DTeP-Hib（PRP-T）-HepB联合疫苗现正在进行临床试验阶段。Nolan等用DTP-Hib[PRP-脑膜炎球菌外膜蛋白（OMPC）]—HepB五种成分联合疫苗在2156名婴儿中作了研究。分别在2、4、6、18个月接种疫苗，采用双盲法随机分组，A组给予五价疫苗DTP-Hib-HepB和安慰剂；B组给予四价疫苗DTP-HepB和Hib；C组给予二价疫苗Hib-HepB和DTP；D组为分别单独使用经批准的对照疫苗：DTP、Hib、HepB；E组采用单价HepB在出生时免疫，紧接着用DTP-Hib-HepB免疫，如同A组。每次接种后7日内记录体温、全身和局部症状。结果证实接种五价联合疫苗时无论A组还是E组，在每次接种时都有没有不良反应，与对照疫苗组反应相似。对白喉、破伤风的抗体水平在各组均高于保护水平；各组抗HBs≥10Miu/ml的百分率不同，D组的免疫效果最好，C 组次之，A组最差；在18个月后各组PRP抗体≥1.0μg/ml的百分率都大于97%;五价疫苗产生的抗百日咳凝集原2、3和粘附素的抗体与对照疫苗组相比有更高的几何平均滴度.以上数据证实；除了抗-HBs应答，通过五价疫苗诱导的对所有抗原的抗体应答与通过同一样独抗原诱导的抗体应答一致。出生时接种HepB疫苗然后接种五价疫苗不影响抗体应答。
4 y2 U. ], i. U6 E9 i# y　　1.3IPV联合疫苗
2 P+ s) u! Y5 r- _8 m5 |　　一些研究指出当IPV和其他疫苗联合使用时机体对脊髓灰质炎病毒的抗体应答减弱。但也有一些研究没有证明这个影响。IPV和DTaP联合，对任何成分的应答都没有影响。再联合Hib也不改变对IPV和DtaP成分的应答。但与其他包含Hib的联合疫苗一样，抗PRP抗体滴度通常较低。自1997年起，加拿大和欧洲开始使用五价联合疫苗DtaP-IPV-Hip（PRP-T）。最近在欧洲六价联合疫苗DtaP-IPV-Hip（PRP-T）-HepB也被批准使用。六价疫苗免疫获得的抗PRP的抗体滴度低于五价疫苗；而脊髓灰质炎抗体滴度却增高；用六价疫苗免疫比单独使用HepB疫苗免疫的儿童的抗-HBs滴度低。以上抗体滴度的差异无统计学意义。
2 V4 m, j% q2 x7 W8 W　　1.4Hib-HepB联合疫苗
+ v7 R2 V* O% o& n- ]: |　　1996年Hib-重组乙型肝炎疫苗（rHepB）联合疫苗在美国获准使用。此联合疫苗用PRP-OMP和rHepB疫苗的抗原成分，用于HbsAg阴性母亲的婴儿接种，可同时预防流感杆菌和乙型肝炎病毒感染。三次分别在2、4、12-15月注射。West选择126例2月龄健康婴儿接受Hib-HepB疫苗与DTP同时免疫，于2、4个月各免疫1次；IPV和OPV在2个月随机免疫，4个月和14-15个月给予口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）；14-15月再给予DtaP和麻疹-腮腺炎-风疹疫苗（M-M-R）。结果证明抗HbsAg、Hib多糖、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳杆菌凝集原、百日咳杆菌毒素抗体及DtaP加强免疫后抗百日咳杆菌丝状血凝素、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型、麻疹、腮腺炎病毒的抗体都有获较高水平，但抗风疹病毒抗体和DTP初次免疫后对百日咳杆菌丝状血凝素的抗体较弱。对于脊髓灰质炎病毒Ⅰ和Ⅲ型抗体在二次免疫后还低于期望值，但在第三次免疫后抗体水平明显增高，达到保护水平。以上可以认为Hib-HepB联合疫苗初次和DTP共同给予，用DtaP、OPV或IPV、M-M-R加强免疫均无不良反应，除风疹病毒外，都保持较好的抗体水平。; x" B5 u. ^; V. E! J! Y# x) A) s
　　1.5HepA-HepB联合疫苗
, s, z* m! F2 F, l　　1996年欧洲批准使用HepA-HepB联合疫苗,以同时预防甲型和乙型肝炎病毒感染.此疫苗在加拿大也相继获准使用.HepA-HepB联合疫苗在儿童、青少年及成人三次免疫有很好的安全性和免疫原性。2001年5月美国FDA批准HepA-HepB联合疫苗可应用到18岁以上的成人。Wiedermann等将志愿分成两组，分别接种HepA-HepB联合疫苗及rHepB单价疫苗，按0/1/6月程序注射，在第二次免疫前和加强免疫后一个月评价其抗HBs滴度及外周血单个核细胞（PBMC）刺激试验（用HbsAg），即淋巴细胞增生反应，比较两组之间有无差异。结果显示抗体在所有时间点上，双价疫苗组，两组的抗体滴度和淋巴细胞增生反应的差异在统计学上都没有显著意义。细胞应答和抗体应答之间的反比关系提示细胞应答不能在所有接种者中作为评价免疫力强的标志，T淋巴细胞应答的强弱不能最终决定抗体应答的程度。两种接种策略都可引起细胞免疫和体液免疫，抗HBs特异性抗体都可达到保护水平。
! p0 [& B- U; w2 W　　1.6M-M-R-水痘(V)联合疫苗
* U" d3 J( X/ a! Z7 f: G, f　　用M-M-R-V疫苗单次注射对于儿童来说不仅能预防麻疹、风疹和腮腺炎，而且对水痘也极其有效。最近有研究指出联合疫苗诱导的抗水痘病毒抗体浓度低于抗其他三种病毒的抗体浓度。在当前临床试验阶段所有的M-M-R-V联合疫苗，都加大了水痘疫苗成分，以增加抗水痘抗体的滴度。
7 R4 }1 c! s3 M8 a, q2. 单疾病多价联合疫苗
; y: D! G# {/ M　　单疾病多价联合疫苗多是根据病原体（如细菌和病毒）的型别较多，而各型别之间交叉免疫性较低，针对不同型别的病原体设计，以预防多个型别感染。一般是由同一制作方式制备出单价疫苗，再混合于同一针剂中供免疫使用。目前世界上常用的单疾病多价联合疫苗包括肺炎球菌、脑膜炎球菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌等菌苗，还包括脊髓灰质炎病毒、轮状病毒等病毒疫苗。
: d5 A' o/ b5 f. @, I% F" i! {7 _　　2.1肺炎球菌多价疫苗+ A* P% l( B* {: o  x; q9 ]+ b) k
　　到目前为止，肺炎球菌已被证实的血清型有90多种，各型别之间无明显交叉保护，所以研究重点多放在多价疫苗上。1983年23价肺炎球菌疫苗被批准使用，此疫苗包括纯化的23个血清型的荚膜多糖。这些血清型可引起85%-90%的成人感染，几乎100%的侵袭性疾病和85%的儿童中耳炎。该疫苗覆盖型别多，在预防相应细菌型别引起的菌血症和脑膜炎效果较好，成人保护率为61%-75%，5岁以下儿童保护率为57%。荚膜多糖疫苗在成人效果明显，但对2岁以下儿童却不能有效的预防由肺炎球菌型别引起的中耳炎，因2岁以下儿童不能对荚膜多糖疫苗产生有效抗体应答。甚至儿童到5岁对6B、14、19F、23F血清型产生的应答也不好，而这些血清型正是儿科感染常见的，并且是耐青霉素的血清型。这些因素都促使多糖蛋白结合疫苗的发展。这些新疫苗的设计思路与Hib结合疫苗相似。但需解决抗原量充足、抗原与载体配对问题，达到既能诱导免疫应答，又不引起不良反应。肺炎球菌结合疫苗比较安全，少数可出现注射部位局部反应。结合破伤风类毒素、白喉类毒素等不同载体蛋白的肺炎球菌疫苗的预防效果较好，可以诱导初次免疫和免疫记忆应答。一些血清型（14、18C、19F）是很好的免疫原，单剂免疫后就可引起抗体保护，而其他一些血清型（6B、23F）则需3剂。所有结合疫苗都可以引起免疫记忆。在初次免疫后获得抗体浓度仅能维持几个月，随后下降到免疫前水平。38000名儿童接种结合于白喉毒素突变体CRM197的7价肺炎球菌结合疫苗（4、6B、9V、14、18C、19F、23F），观察免疫效果。在预防任何肺炎球菌血清型引起的侵袭性疾病89%有效，而对于这7种型别的感染有效率为97%。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。今后，可能针对不同人群制备易感的相关血清型结合疫苗。4、6B、9V、14、18C、19F、23F型7价疫苗用于预防中耳炎，1、2、5型疫苗用于预防肺炎球菌菌血症。
, i- c5 Z& }4 u5 B! L6 u　　2.2脑膜炎球菌多价疫苗
5 z& L" S5 N2 G　　脑膜炎球菌可引起细菌性脑膜炎，在世界范围内都有很高的发病率和死亡率。在不同血清群中A、B、C群引起的感染占90%，但是最近几年此病的流行病学特征有些改变。在欧洲和北美C群流行增加，在美国和瑞典血清群Y增加。脑膜炎球菌W135曾在沙特阿拉伯2000和2001年两次引起爆发流行，这使得该国卫生部门改变了免疫策略，将A、C、Y、W135四价疫苗代替A、C二价疫苗。2 `6 O% r" I* C. d; o* j. g$ F+ `
　　美国现在批准使用的四价脑膜炎球菌疫苗是从4种主要血清群（A、C、Y、W135）提取的荚膜多糖，免疫原性适当，但免疫应答持续时间不长，不能被再次接种所加强。多糖疫苗总体来说不能诱导2岁以内的儿童免疫应答，C群疫苗在此年龄段免疫原性不理想，A群较好，潜在机制不清。脑膜炎球菌疫苗的设计也正向于多糖蛋白结合疫苗，以便增加免疫原性，诱导免疫记忆。
' m0 ^+ u) s; E) H  T% z# ~+ W+ u　　2.3轮状病毒疫苗
9 V7 B- Y9 \; L$ c+ Z, _" O9 K( u$ f　　轮状病毒是引起5岁以下儿童急性胃肠炎的最常见病原体，严重感染可导致儿童死亡。轮状病毒血清型多，可分为A-G7个组，A、B、C组与人致病有关。其中A组根据VP7抗原分为14个血清型。不同地点和不同时间引起疾病的轮状病毒血清型也发生变化。美国1998年批准使用活的口服四价轮状病毒疫苗RRV-TV。它将对人不致病的减毒猴轮状病毒与对人有致病性的野毒株基因重配，获得含有4个血清型VP7抗原的四价轮状病毒基因重配减毒活疫苗RRV-TV。RRV-TV的效果评价分别在几个国家作了4组临床试验。4组研究结果一致。该疫苗预防轮状病毒腹泻的有效率为48%-68%，预防重症感染的有效率为70%-100%。在芬兰证实，预防院内感染有效率为100%。但临床上接种疫苗的儿童肠套叠的发生率明显增高。为此美国ACIP和AAP撤回了推荐使用RRV-TV疫苗的建议。但RRV-TV和肠套叠之间的关系还不清楚，尚需近一步研究。
& a& Y9 K6 `0 O' h( X, \# u% Z$ d3. 以DPT为基础的联合疫苗- x  h1 E  k- s, f0 X
       DPT已广泛使用40多年，长期预防接种实验证明疫苗安全有效，已纳入EPI，在全世界儿童中普遍使用。同时，DPT成分抗原（尤其是白喉和破伤风类毒素）化学性质稳定，不大可能与可能加入的其他抗原之间发生干扰。而且发展中国家使用的DPT约有60%—70%是这些国家自己生产的，目前用于生产DPT的技术在可预见的将来不大可能被取代。因此，CVI将以DPT为基础的新型联合疫苗列为优先开发项目。5 G  p3 f4 _5 J/ ^9 C) r8 Y
       研究开发以DPT为基础的新型联合疫苗，目前有两种设想和步骤。一是在现有DPT基础上加入新的抗原成分，逐步发展成能预防更多疾病的联合疫苗，如DPT—IPV—HB—Hib—HA—RSV（呼吸道合胞病毒）联合疫苗；或是DPT—HB—Hib—IPV—HA联合疫苗。另一设想是在研究可控释放破伤风类毒素的基础上，开发注射1剂的DPT联合疫苗，进而开发注射1剂的DPT—HB联合疫苗。以上联合疫苗组成的设想，是根据防病需要和技术可行性而提出的。如HB疫苗将被许多国家纳入EPI，b 型流感嗜血杆菌感染在发达国家中是一种严重疾病，IPV可能替代OPV，所以都优先考虑这几种疫苗与DPT疫苗联合，组成新型联合疫苗。$ r: V) l- h: n3 k$ k2 i" m
4.以活疫苗为载体的联合疫苗4 q( R8 K. {' n1 A! K+ m! j
       生物技术的进展为重组疫苗提供了新的途径，将外源DNA引入预定疫苗载体构建此类疫苗，可将保护性抗原传递至宿主免疫系统。细菌和病毒都可以作为重组疫苗的载体。即将编码目标抗原的基因插入现有活疫苗如痘苗、BCG等疫苗株的基因制成载体疫苗。以痘苗病毒为载体开发新型联合疫苗具有许多优点：痘苗病毒基因组容量大，非必需区多，可用于多种外源基因插入，适用于开发联合疫苗；痘苗病毒稳定，37℃可保存4周，运输不需冷链；采用皮上划痕免疫，使用方便，可给婴儿接种；痘苗病毒易于培养，宿主范围广，无致癌性，生产工艺简单，发展中国家具有生产这种疫苗的能力；生产设备及使用原材料所需费用少，疫苗价廉，以上这些特点均符合CVI开发理想疫苗的战略要求。但以现有痘苗病毒为载体发展联合疫苗，也存在一些问题。如种痘引起的接种反应不易被受种者接受；痘苗病毒是增殖性的，对已具有痘苗免疫力的受种者不能再作加强免疫等，所以还必须寻找新的载体以克服以上不足。# S1 c1 y  Z9 [2 j6 W  T
5.口服联合疫苗
) V# @% Q: C" i. n       20世纪50年代起即已广泛使用OPVI、II、III型3价活疫苗，获得满意的防病效果。口服腺病毒4、7型2价活疫苗在美国士兵中使用亦已20年，证明安全有效。CVI将粘膜免疫法亦列入优先开发项目。这是基于：口服或滴鼻免疫方法简易，易被受种者接受；约有80%-90%传染病的病原微生物是通过粘膜组织进入机体引起，如粘膜已有针对病原微生物的免疫力，在病原微生物播散之前即可被清除。粘膜是一个巨大的免疫系统，不同粘膜部位的免疫学活动可通过共同的免疫系统联结；粘膜免疫产生SIgA，除能阻止病原微生物粘附于粘膜表面并被其吸收外，还可在粘膜上皮细胞中中和病原微生物，或在粘膜中与病原微生物形成复合物，由上皮细胞将其排出处理，所以有很强的免疫作用。但粘膜免疫也有一些缺点，如使用的疫苗量比注射用的大，才能获得同等程度的免疫力；需多次免疫；获得的免疫力衰退较快；以及口服疫苗易受消化液的破坏等。随着新技术的开发及应用，以上不足可望得到克服。. k3 e' o9 h4 w7 D+ l
       随着联合疫苗的研究和应用不断完善，越来越多的疫苗可作为联合疫苗用于免疫。同时制备灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程亚单位疫苗的技术和方法也在不断成熟。这些疫苗在确切了解其免疫原性和安全性基础上，将其联合使用，这样给人们带来极大的方便。相信不久的将来，联合疫苗将作为免疫生物制剂的主体而应用于全世界。

联合疫苗的应用及问题+ B  M/ J. L# ~- A

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       联合疫苗的使用，扩大了1次预防接种的防病范围，提高了免疫接种率，减少了接种器材及劳务费用，有利于免疫计划的安排，受种者及其家长/监护人亦易于接受，并推动了EPI的实施。但现有的联合疫苗在使用中也存在一些问题。
2 |4 n% ~% |- |1 t" j7 P% @1 k       一是有些联合疫苗如DPT、OPV等，需接种多次，易发生脱漏而不能完成全程免疫，或免疫间隔不符，这些都会影响防病效果。同时多价联合疫苗的一个特点是有时它不能对所有的血清型提供保护，尽管3价脊髓灰质炎疫苗可以覆盖所有脊髓灰质炎病毒株，但3价流行性感冒疫苗则不能。1个8价的结合肺炎球菌疫苗只能期待覆盖70%—80%的儿童肺炎。这些信息需要清楚地转达给卫生工作者，使他们对疫苗的有效性有一个现实的期待植。同样，一种疾病可由多种致病微生物引起，如Hib、肺炎球菌和脑膜炎球菌都可引起小儿脑膜炎、肺炎；Hib和粘膜炎莫拉氏菌（Moraxella Catarrhalis）都可以引起急性中耳炎；轮状病毒可引起50%小儿腹泻等。这些情况应在结合肺炎球菌疫苗、结合脑膜炎球菌疫苗和轮状病毒疫苗的使用指导中加以明确。  p4 `  @8 }- N! {# ]' X
       二是有些联合疫苗如MMR是活疫苗，对热不稳定，需在冷链系统中保存及运输。冷链装备的配套及运输费用，据估算可占预防接种所需费用的一半，使一些发展中国家难以承受。
( e+ u- l1 R+ F' R$ B$ D       三是目前实施的EPI，只是预防了部分儿童传染病。除现有疫苗外，尚有10多种儿童传染病可用疫苗预防，这些疫苗均在研究开发中。随着新疫苗的开发，按防病需要将逐步增加EPI的内容，如WHO已提出将病毒性乙型肝炎（HB）接种纳入EPI，一些发达国家还包括了Hib。今后将有更多的疫苗逐步纳入EPI，如都是单一抗原成分的疫苗，按现行的免疫程序，免疫计划将很难安排，受种者在出生后1年内很难完成众多疫苗的疫苗接种。因此，为提高防病效果和降低费用，亟待研究开发新型的联合疫苗。! m! k( ^& o  O4 _
       但是，不同的国家免疫程序不同，故联合疫苗应有接种程序的可塑性。一个尚无统一认识的问题是DPT和HB的接种程序。WHO推荐在乙型肝炎高发国家HB的接种程序是0、1、6。这与传统的DPT接种程序不一致。给DPT/HB或DTacp/HB在这些国家的使用带来困难。未来联合疫苗的发展将基于区域性流行病学调查，但联合疫苗的使用在发展中国家有不同的成本效益比。市场导向的疫苗开发者因增强与国家免疫计划的顺应性，以便使更多的人群受益于联合疫苗。

DNA疫苗原理

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       随着科技的发展，疫苗技术也在不断进步，从传统的死疫苗，减毒活疫苗发展到近几年十分热门的核酸疫苗。核酸疫苗是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种全新的免疫预防制剂。所谓核酸疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体或基因序列作为疫苗，直接导入受试动物细胞内，通过宿主细胞的转录系统转录并翻译成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使被接种者获得相应的免疫保护。目前研究使用得最多的是DNA或cDNA，所以核酸疫苗又称为DNA疫苗。
1 j4 K9 B2 }& r/ h! i6 ]4 z       DNA疫苗是当前国内外疫苗研究的热点，是指用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重组体。用DN A疫苗免疫可有相应的蛋白质表达，表达的蛋白质可在体内诱生特异性体液或细胞免疫应答，也被称为裸 DNA疫苗，因为构成乙醚靠的DNA-蛋白质复合物中只有DNA而缺乏蛋白质。* Y0 _+ ?7 x  F& Z
       DNA疫苗（DNA vaccine）是继灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗之后出现的一类新型疫苗，开辟了疫苗研究的新纪元，被喻为第三次疫苗革命，与传统的疫苗相比，有许多崭新的优点，被称为第四代疫苗。它的出现有望可以解决传统疫苗受母源抗体干扰较大，对变异株免疫效果差，副作用明显，以及贮存和运输不便等问题，并且有望可用于自身免疫病和肿瘤的治疗，因而具有广阔的应用前景。
8 Y& I4 T% L% }( V/ u       不同的免疫途径接种DNA疫苗，其诱导产生免疫应答机理不同，免疫效果及其持续时间也存在差异。DNA免疫可诱导保护性体液免疫苗对特异性CTL为标志的细胞免疫。自从1990年Wolff等人发现直接肌肉注射裸DNA质粒，不经任何特殊载体手段即可在肌细胞内取得有效的蛋白表达以来，目前已在病毒、结核杆菌、寄生虫以及肿瘤疫苗等方面进行了深入的研究，同时对DNA疫苗的接种途径和免疫效果进行了探讨。
; [+ K8 A: w* y* U4 KDNA疫苗的产生背景; ~2 L* J2 W. h9 x6 z/ _( c3 f
       DNA疫苗又称核酸疫苗（nucleic acid vaccine）或基因疫苗（genetic vaccine），它是将编码某种保护性抗原的基因克隆入真核表达质粒，直接导入宿主细胞，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。由于不加任何佐剂或载体，故又称裸DNA免疫。9 e  B: h9 D1 W
       1990年Wolff等在做小鼠基因治疗试验时偶然发现，将编码基因的质粒DNA直接注射入动物肌肉细胞内，能在动物体内表达抗原并诱导机体产生免疫应答。这一发现打开了通往新的免疫途径的大门。1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。在DNA疫苗出现的10余年时间里，对其制备工艺，生物安全性以及免疫机理方面的研究均取得了长足的进步，其发展速度是惊人的。FDA和WHO分别制订了关于DNA疫苗制备、质控标准、临床前、临床试验要求、安全性问题等的指导性文件——《质粒DNA疫苗预防传染病指征的考虑要点》和《DNA疫苗质量保证的WHO准则》。0 L8 B% C# }, f0 k) `7 @  F
       近年来有关质粒DNA疫苗可在小动物和大动物上产生预防和治疗作用的研究报道迅速增多，应用的范围也在不断地扩大，如抗HIV DNA疫苗、抗流感DNA疫苗、抗狂犬病DNA疫苗、抗乙型肝炎病毒(HBV) DNA疫苗等。其中抗HIV DNA疫苗已经分别被美国FDA和英国医药管理局（UK Medicine Control Agency）批准进入临床试验，猪瘟DNA疫苗已经进行了规模化生产工艺研究，其它DNA疫苗在临床前试验中也获得了成功。

DNA疫苗免疫机制# h/ z: U1 l1 R: _6 X% ]0 X

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       目前对核酸免疫作用机理的认识主要还仅限于理论推测，且多数资料来自基因治疗试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。
+ @: @9 F6 i' i% K       核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。
9 p6 T2 X2 \; i, \9 B0 c" p$ ]+ p       DNA疫苗常用于表皮，肌肉和静脉接种DNA，均可产生保护性免疫应答。接种后，可诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。以多种病毒、细菌、寄生虫的结构成分和非结构成分制备的DNA疫苗在多种实验动物中，均诱导出不同程度体液和细胞免疫反应，发挥出对同源或异源病原体攻击的保护作用。DNA疫苗免疫机制不能用常规疫苗刺激机体产生抗体来解释，它不符合构成抗原的条件。目前，DNA疫苗的免疫机制尚无定论。
' u1 \2 B; p7 ~/ v" w3 c: F$ I% X       一般认为，免疫反应的发生可能是由于抗原提呈细胞（Antigen presentation cell APC）提呈核酸疫苗在骨骼肌细胞表达外源抗原，这种抗原既可刺激B细胞产生抗体，又可经内源性抗原递呈途径MHCＩ分子结合，提呈细胞质内表达的抗原蛋白给CTL诱导CTL应答，APC还可摄取由其他细胞表达的抗原，经外源性抗原递呈途径与MHCⅡ分子结合，激活CD4+Ｔ细胞。. I" }5 N2 x- a4 B5 p0 Q
       皮肤接种常用于表皮或皮下接种方式。皮肤及黏膜组织大多首先与外来抗原接触。在皮肤相关的淋巴组织中含有多种 促进免疫应答的专一细胞。其中角质细胞为主要表达细胞。它可产生IL-1,TNF-a，可激活表皮中的APC如树突状细胞，巨噬细胞，朗罕细胞，将摄取和加工处理的抗原转运到淋巴结。这些细胞除可直接摄取和表达质粒DNA外，还可摄取，表达由死细胞释放的外源DNA。在外源基因启动子作用下，使外源基因表达，产物在细胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽。其中一部分转移至内侄内质网(ER)腔内，与新组装的MHC-I类分子结合形成抗原肽：MHC-I类分子复合物，逼供内提呈给CD8+T细胞，诱发特异性细胞杀伤效应。另一部分转移到溶酶体和内体，经加工处理降解为多肽，与MHC-II类分子形成抗原肽：MHC-II类分子复合物，将抗原提呈给CD4+T细胞，活化的 Th1型CD4+T细胞分泌细胞因子，并使巨噬细胞活化，活化的巨噬细胞能吞噬胞内寄生病原生物，如结核杆菌，麻风杆菌等，也能吞噬所中胞外细菌。活化的Th2型CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,与 B细胞增殖，成熟，促进抗体生成有关，可增强抗体介导的免疫应答。. v# s) D0 l9 w
       骨骼肌细胞是目前所知摄取外源DNA效率最高的组织。但无MHC-II类分子，只表达较少的MHC-I类分子，缺乏共刺激分子B7的专职APC，但非专职APC也可有效地将抗原提呈给T细胞。由 T细胞接受肌肉细胞表达的抗原肽：MHC-I类分子复合物的第一信号，同时接受炎症反应吸引的来自血液免疫细胞所带的共刺激信号而活化。提示抗原提呈与共刺激新并不是要由同一细胞提供，此外，肌肉细胞表达的抗原可通过某些途径转移到专职APC 内，由专职APC将抗原加工处理后，提呈给CD4+T细胞,CD8+T细胞，诱导出细胞免疫和体液免疫。尽管肌细胞本身不足以诱导CTL ,但肌细胞通过表达多种细胞因子，当表达IFN-a,TNF-a时可诱导MHC-I,MHC-II类分子ICAM-1/CD54, LFA-1,LFA-2,LFA-3的表达，由此可诱导产生细胞免疫和体液免疫。9 w: A6 O; q, o' ~# m0 U
       最近还有研究表明， DNA重组技术可提供一种能产生大量用作疫苗的特异性抗原的新途径。并在原核细胞中已完成了许多基因的克隆和表达，但其细胞产物的免疫原性一般不太满意。在某些情况下，原核细胞不能修饰蛋白质（如糖基化），并被认为是导致低免疫原性的原因。但嵌合基因的表达可导致“外来”肽与载体蛋白融合，从而增加外来肽的免疫原性。因此，增强重组细菌产物免疫原性可以通过产生融合蛋白来实现。
/ F5 F' G$ w1 C- W, F1 体液免疫反应
4 i( ?; D) x* P& U, q2 k4 P+ L8 |       基因疫苗注射到机体后，质粒所携带外源基因可被肌细胞摄取，并在肌细胞中表达。这种在体内表达的产物对宿主而言是异物，可以作为免疫原启动机体的免疫系统产生抗不同细菌、病毒、肿瘤以及真核蛋白的抗体[3]，所产生的抗体主要为IgG，此外，还有少量的IgM和IgA。抗体水平达到适当程度，就可以抵抗相关病原的侵袭，达到预防的目的。　1 A" z& D2 g& h% U$ k- S
2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应
/ E% l7 s5 W  I       CD8+的CTL是预防和清除细胞病原体的主要免疫因素，而应用亚单位疫苗常常难以诱导。基因疫苗免疫的优势在于它诱导体液免疫应答的同时，主要诱导细胞免疫应答。7 M0 c* R8 _5 |5 b
       DNA疫苗接种动物后，可使机体产生MHCⅠ类CD8+细胞毒T淋巴细胞（CytotoxicTCell，CTL），CTL能够识别并杀死感染的相关抗原，在免疫反应中具有更为重要的作用。$ _! l4 t- f) M& @: g, }" d* E8 a
       用编码有流感病毒核蛋白(NP)的DNA疫苗免疫动物1年半以后，仍可检测到高水平的抗-NP CTL反应的存在，说明接种DNA疫苗所产生的CTL反应是长期的。% l8 F; e3 d- `, \) n
3 诱发异源性保护免疫　　! |, g' P9 V2 p. }0 E$ Q- _
       DNA疫苗免疫接种可诱发异源保护性免疫的产生，CD8+ CTL的Ｔ细胞受体可识别与MHCⅠ类抗原分子有关病毒的肽表位，从而对被病毒感染的细胞产生细胞毒作用。这些肽是从内源合成的病毒蛋白衍生而来的，与该蛋白在病毒内的定位和功能无关，故通过识别保守病毒蛋白的抗原表位，CTL可产生株间交叉保护作用。利用编码某病毒保守蛋白的质粒，直接接种宿主，诱导抗原特异性CTL的产生，以诱发毒株间的交叉保护作用。其所产生的异源保护作用的强弱，取决于病毒蛋白的保守性。/ G0 }% M6 E4 e( ]5 i
4 辅助性T细胞反应　. K7 m6 |. O4 Y2 B6 I+ _: Z$ ^5 S6 L
       APC细胞可以将某些天然过程中胞内合成的外源蛋白（简称为内生性蛋白）抗原直接引入到MHCⅡ类呈递途径，呈递于细胞表面[4]，激活CD4+Ｔ细胞即Th细胞，引起Th细胞的活化增殖，活化的Th细胞分泌大量的可溶性细胞因子，进一步调节其它免疫细胞的效应机制，如IL-2、干扰素等，支持细胞反应，使CTL及IgG2a在免疫反应中占优势地位，称为Thl型反应，Thl型反应导致炎性现象；另外一些细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等，促使Ｂ细胞的增殖和其分泌抗体类型的转换，使IgGl在免疫反应中占优势地位，称为Th2型反应，Th2型反应促使抗体形成。这种辅助作用对于DNA疫苗免疫的最终结果有很大的影响。另外, CD4+Ｔ细胞还可增强CD8+Ｔ的CTL的效应细胞的杀伤功能。" i5 N, l8 C4 j, f, X
       MHCⅡ类限制性CD4+ T淋巴细胞可产生不同的细胞因子，辅助性T细胞反应的产生，与DNA疫苗接种方式有关，肌肉注射免疫易于产生Thl型反应，基因枪接种倾向于产生Th2型反应。在免疫反应中，Thl型和Th2型免疫反应的产生并不是绝对的，而是在某些条件下，存在着Thl型和Th2型反应的相互转换。

DNA疫苗的免疫注射途径
" I$ e2 J% I0 r% M* I& p* c( R

( O5 z9 E9 m2 x, {& r3 h- M* `1 肌内注射* ?$ A+ T! t8 m  \4 a
　　目前大部分研究者认为包括骨骼肌和心肌在内的横纹肌系统是最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织。肌肉组织具有安全、体积大、免疫接种容量大的优点，因此多被用来进行DNA免疫注射。
( G8 K. P0 X6 o. E" t3 Z" G3 {. k, M　　1）肌细胞对质粒DNA表达载体的摄取机理。
% {$ [# b8 O, X　　质粒DNA载体进入肌组织后，在肌纤维外间质内扩散，影响扩散的主要屏障是肌束膜。灵长目动物肌组织中肌束膜较啮齿类动物厚且致密，因此灵长目动物中肌注外源性DNA的表达率较啮齿类动物低。
3 e" G  M# w' r& w2 ?5 _3 VDNA免疫过程中肌纤维对外源质粒摄取的具体机制目前还不清楚。骨骼肌具有丰富的T小管系统和肌浆网结构，T小管中有较多的细胞外液，这些结构上的特殊性有可能使骨骼肌肌纤维直接摄取外源DNA。Davis等[3]研究发现预先注射心肌毒素使肌纤维处于再生状态，只有当肌纤维分裂处于多核状态时，才可摄取质粒DNA，而单核的未成熟肌纤维则无摄取质粒DNA的功能，说明只有肌纤维分化形成T小管系统后，才能摄取外源DNA。肌纤维摄取DNA的过程有三种假设：& W+ Y, ~8 q. Z# f
　　①认为质粒可被处于分裂活跃状态的肌卫星细胞摄取，然后相互融合分化成新的肌细胞。但是目前来看，心肌组织和骨骼肌都能同样有效地在体内摄取外源DNA，而心肌组织中并不存在肌卫星细胞，因此可以认为肌卫星细胞介导的DNA摄取过程不是必需的。Wolff等也未在啮齿类及灵长目动物的肌卫星细胞中发生注入的β-半乳糖糖苷酶报道基因的表达；7 M0 O" s2 M+ b; Q6 X
　　②认为注射过程中液体流的冲击作用或针头直接损伤了肌纤维的肌膜，使外源DNA沿破口进入肌浆中。骨骼肌具有多核、体积大的特点，可以修复肌膜而存活下来表达DNA产物。但多数学者不支持该种观点。因为心肌细胞虽然缺乏如肌骼肌的修复能力，但这并不影响对外源DNA的表达。同时发现对肌组织多部位针头刺扎反而减少了质粒DNA的表达。将金颗粒包被的质粒DNA、多聚赖氨酸或多聚谷氨酸三种颗粒共同转染骨骼肌，电镜下仅见结合有质粒DNA的金颗粒穿过肌纤维膜进入T小管及膜穴样内陷（caveolae）中，其它两种金颗粒均存在于肌纤维基膜外的间质中，进一步证实了肌纤维对质粒DNA的摄取不可能是通过肌膜破口；
2 C$ D2 p; _9 @- g( A9 X　　③Wolff等认为，骨骼肌在收缩过程中肌浆网中Ca++外流进入肌浆中，致使肌纤维胞液中正电荷增加，导致带负电荷的DNA穿过基膜进入 t小管和膜穴样内陷中，这一过程不需能量介导，但存在质粒尺寸限制。他们认为质粒DNA与T小管腔膜或膜穴样内陷的包膜之间有特殊亲和力，在肌注100-500µg质粒DNA5分钟后，电镜观察显示，质粒出现在完整肌纤维的T小管系统及膜穴样内陷中。进入膜穴样内陷中的DNA通过potocytosis作用消耗能量穿过肌膜进入肌浆中。膜穴样内陷与有被凹陷不同，无笼蛋白存在，其内包含的特异受体通过GPI（glycosyl phosphatidyl inositol）锚定于膜穴样内陷的内侧包膜上，DNA进入呈开放状态的膜穴腔内后与受体结合，穴腔关闭向肌浆内迁移，腔内低pH环境便于DNA与受体分离，通过浓度梯度利用穴腔肌浆侧包膜内的载体蛋白进入肌浆中。穴腔与包含的受体再循环至肌纤维表面，呈开放状态以携带其它的DNA分子。Potocytosis仅能摄取分子量小于1000～2000Da的小分子，而DNA的环状构型横向直径仅为2nm×4nm，可以通过potocytosis途径进入肌浆中。
4 K8 I* D) E9 ]$ x* H　　Wolff等指出，DNA利用的可能是其它分子的potocytosis通道，而非DNA特异性的，这种通道特异性存在于横纹肌内。Cox等发现将一定量的质粒DNA和非编码DNA（如鲑精DNA）一起肌注免疫时，当逐渐增加非编码DNA量时，质粒DNA摄取明显受到抑制，这种竞争性抑制现象提示DNA的摄取是由受体介导的。但也有学者认为，DNA的摄取是通过胞饮作用，或有被凹陷中的特异受体介导。Hagstrome等认为DNA可通过肌浆网而进入肌浆中，在肌浆网的膜结构中存在特异DNA结合蛋白，分子量为60和90KDa,可与双链DNA结合，而不与单链结合。这一假说开始受到越来越多的重视。
% I% ~& c  h7 T5 w# c& |　　2） 肌细胞对外源DNA的持续表达
' B5 w7 I  @" r1 g　　Wolff等将编码β-半乳糖糖苷酶的报道基因注入小鼠后腿肌中，经组织化学染色发现，注射区约有10～30%肌纤维染成兰色，纵向染色深度可达400µm，说明肌纤维可以摄取并表达外源基因产物。用编码虫荧光素酶的质粒DNA免疫小鼠后发现，表达的酶活性呈DNA剂量依赖关系，而且报道基因可持续表达19个月之久。Wolff等进一步利用定量PCR技术，发现大多数的质粒的DNA载体可以在肌纤维内稳定持续存在，并表达；而mRNA转录产物及表达的蛋白稳定性较差，不能持续存在。作者认为质粒DNA载体的稳定性主要与肌细胞的分化终末特性及多核特性有关。Danko等的研究发现，肌注的外源DNA以非甲基化的方式存在于细胞染色体外，并不与染色体发生整合，也不进行复制，并且表达水平受肌细胞有丝分裂率影响，分裂加速的肌细胞，对外源基因丢失亦加速，表达水平下降。作者同时指出，共价闭环的外源质粒DNA载体较线状构型更利于表达。也有作者认为，肌细胞对外源基因的持续表达与肌细胞分化终末特性有关外，肌细胞表面MHCI类抗原较少，因而不易被活化的特异性CTL溶解，使质粒DNA得以长期存在于肌细胞内[1]。此外肌细胞合成分泌的外源存在于产生的特异性抗体可以形成抗原抗体原合物，并沉积于树突状细胞表面，可长效释放Ag，诱导产生记忆性T、B细胞。8 Q* R& h" z: j/ }; F0 P8 O
　　3） 肌注途径中外源基因表达产物的提呈机理。目前关于肌肉组织中的抗原提呈机理提出了三种假设：
6 [6 ?* O  x/ Z* I, G  J5 L( ]/ _　　（1）肌细胞表达外源性DNA，并自身将抗原提呈给T、B淋巴细胞；
1 Q! Q- X" ]; K, u0 C. u. |　　（2）肌细胞表达并分泌外源性抗原，或由于肌细胞的损伤、局部炎症以及活化CTL对转染肌细胞的毒性作用使表达的蛋白抗原释放于细胞外。这时定居于肌肉组织中，或循环经过的专业APC细胞承担下一步致敏免疫系统的任务；0 u6 V) y% z, Y) p* u
　　（3）DNA免疫时直接转染APC细胞，通过抗原加工呈递，最终诱导免疫应答。参与DNA免疫的专业APC细胞可以是定居于肌肉组织中的APC，也可以是血循环经过注射部位的APC细胞。( h: C3 I7 S) {
　　Rouse等亦发现巨噬细胞有摄取质粒DNA表达载体的功能，其表达分泌的蛋白抗原随后由树突状细胞参与加工，提呈。有些学者将质粒DNA表达载体注入小鼠左心室壁中，发现心肌组织与骨骼肌一样，要摄取外源基因，持续表达至60天左右。但与肌骼肌不同，心肌组织对启动子的组织特异限制较骨骼肌明显，且表达量常受激素调节。! i6 G5 p/ a% F( u( [; I7 W
2 皮内注射1 _; j  I# T; Z- `, u4 v
　　与肌肉注射相比，尽管内注射转染率较低，但高的转染率并非决定免疫效果的唯一因素。皮肤组织由于代谢较快，导致外源基因产物的表达为一过性。但该部位具有很多参与抗原提呈的细胞，通常只需极少量的DNA疫苗即可诱发长时间的保护性免疫。Raz等[15]皮内一次性注射0.3～15µg裸DNA，诱导产生的特异性CTL可持续达68-70周，并且产生的抗体滴度也较同剂量DNA肌注免疫为高。皮内注射转染较低，但仍具有很好的免疫效果，原因可能是：
! `6 Z4 y6 ?/ E　　①角质细胞可分泌IL-1及TNF-α，活化淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞；% f2 C1 Y% s, ~. |7 W
　　②含有丰富的郎罕氏细胞，可将抗原携带至局部的皮肤相关淋巴组织中，激发初始免疫的作用；* @, w3 b* ^2 p# h  n8 s/ e
　　③巨噬细胞、树突状细胞提呈抗原起维持免疫反应的作用；
8 X5 e- _2 d( f4 Y! g' ~' T5 A6 f　　④存在外周血循环中的嗜表皮T细胞可归巢定居于表皮内，诱导皮肤免疫反应；
% H1 C2 ]# Y; F9 l% a　　⑤皮肤是具有高水平免疫监视系统的组织，在表皮附近，富含淋巴组织。
6 C" `. `( P3 C- j" \2 h. g$ o9 v　　表皮内APC细胞可被质粒DNA直接转染，或是摄取其它细胞释放的质粒载体，经表达、加工、提呈抗原，诱导强烈而持久的保护性反应。表皮内含有较高浓度的脂皮质素（lipcortin），因此皮内注射不易产生局部炎症反应，并且减轻了长时间表达外源抗原的细胞在局部诱导的免疫应答，有助于抗原的长期表达。作者指出，只要质粒DNA表达载体能够穿过角质层，接近皮肤相关淋巴组织或其他具有免疫活力的皮肤细胞，不论是采用基因枪免疫，直接注射法还是无针注射法，均可产生较好的免疫应答。Hoffman[16]认为，肌注与皮内注射两条免疫途径并不能绝对分出孰好孰差，应根据不同的目的基因选择合适的免疫途径。' C) B0 r9 J' w* J' _
3 鼻内滴注及鼻腔喷雾法% x3 y4 X/ `, f+ \1 |- \
　　粘膜作为防御大多数病毒、细菌入侵的第一道屏障，在免疫防御中具有重要作用。Cohen[17]通过鼻内滴注含编码流感病毒抗原的质粒DNA载体，来预防呼吸道病毒的感染。Okada等[18]报道小鼠鼻内滴注含编码HIV-1抗原的DNA载体，可诱导TH2型免疫应答，在粘膜处可产生高滴度的特异性SIgA抗体，粪便及阴道液中该种抗体含量亦较对照组高，血清中也可检测出高滴度的特异IgG抗体。Okada认为，DNA通过粘膜免疫获得较好免疫效果的原因在于呼吸道具有较大的表面积，上皮覆盖广，存在相关淋巴组织，有利于进行免疫监视。研究还发现，用阳离子脂质体包裹DNA进行免疫可增加特异性抗体滴度及CTL反应活性。将编码HIV-1 dNA载体与编码IL-12的质粒在脂质体包裹下共转染时，可同时增加特异性IgG2a抗体滴度及CTL活性，使免疫反应倾向于Th1型，但对特异性SIgA抗体的产生并无抑制；将编码HIV-1 dNA与编码GMCSF及IL-12的质粒在脂质体包裹下共转染可增强细胞介导的免疫应答。/ B; A% p/ _% I
4 其它DAN免疫途径
+ \) j9 G! P) d. z6 d  o& l4 v　　包括静脉内注射法，腹腔内注射法及皮下注射法。静脉内注射质粒DNA表达载体，可使包括肺、脾、淋巴结、骨髓等在内的几乎所有组织发生转染，其中肺、脾外源基因表达率最高。腹腔内注射质粒DNA表达载体，可转染脾脏中T淋巴细胞及骨髓来源的造血干细胞。皮下注可诱导注射区局部组织发生免疫应答。三种途径均未发现对机体有毒性损害。

DNA 疫苗免疫效果主要影响因素
) ^& f; W$ b  ]$ y( m& `1 T

# o; }  }6 N  A
1.目的基因的选择  
- p  s3 R8 @! l3 E+ G$ P       目的基因即疫苗DNA的构建和选定，这是决定核酸免疫效果的关键。最好选择病毒的主要保护性抗原基因。殷震（1998）指出，构建同一病毒不同基因的融合基因或者分别构建各个基因各自的表达质粒后进行联合接种，常可收到最佳的免疫保护效果。+ c, ?# ?# l, s- `
2.载体质粒及启动子的选择  
) D2 X1 U) o9 H       载体质粒的种类及其结构组成对核酸免疫的水平有明显影响。研究发现PUC19表达效果优于PBR322。而且，表达载体能否在哺乳动物细胞中高水平表达，启动子也很关键。当前所有的启动子主要有CMV、RSV、SV40、MMTV－LTR、ALV－LTA等。研究指出，含CMV、RSV的载体表达水平较高，更适用于核酸疫苗% y  F) ]- D! b" V7 h5 N3 g
3.接种方式
! }6 D: m7 W5 w3 r! ~' w! `       Leitner等将编码疟原虫环子孢子抗原的质粒通过肌注途径和基因枪介导的表皮途径免疫BALB/C小鼠。研究发现，基因枪皮内接种比肌肉内直接注射的免疫效果要好。免疫效果前者比后者高600-6000倍，且所用DNA剂量也减少。由肌肉注射的100-200ugDNA疫苗减至用0.04-0.4ug纯化的DNAS。1 N# S4 \0 W# S% P
4.接种途径
8 b: Z' q( ]  G! A* e' J       Fynan等发现骨骼肌注射接种免疫效果最佳。真皮，表皮，静脉注射效果较好。腹腔内注射效果较差。6 z5 V. I& ], a/ |. A- R
5.接种部位的预处理
& e& O; L' q: N6 J, U7 S2 |$ x       Davis等对小鼠免疫前肌肉注射100ul 10mmol/L心肌毒素，然后接种HbsDNA疫苗，结果发现产生抗Hbs抗体水平比对照组高10倍以上。另有实验表明，在注射部位用25%高渗蔗糖进行预处理，可提高疫苗DNA的表达水平。Danko等在接种DNA疫苗前7天注射0.5%-0.75%丁哌卡，是疫苗DNA的表达水平提高40倍以上。而且，预先给接种的肌肉部位注射蛇毒或局部麻醉剂，然后再做核酸疫苗的注射，也可提高表达水平。4 O7 t% ^2 a& e* ~# ~" @' M; g
6.接种剂量和次数: R$ y9 G+ H7 m8 K1 g- [, G
       研究表明，免疫应答的强度与免疫剂量和次数有一定的关系。DNA疫苗在临床试验的免疫程序一般是3次，Ｕｌｍｅｒ等报告，给小鼠分别注射１～１００ｕｇ甲型流感病毒ＨＡ或ＮＰ ＤＮＡ疫苗，结果抗～ＨＡ和抗～ＮＰ水平与接种剂量呈正相关。, ?+ ~/ q% \3 h" l4 h
       而且，提高接种剂量可否提高体液和细胞免疫水平，是随着抗原基因的种类不同而变化的。对于无毒性的表达蛋白，应采用较高剂量和较多接种次数，这将产生较高水平的表达蛋白和抗体。但对于毒性蛋白的表达，可能过早杀死转染细胞，阻断转染细胞继续产生抗原，以致不能维持免疫刺激，从而呈现负面效应。因而，在这类毒性蛋白中，最好不要设计和应用高表达载体，如5’，端含有内含子的CMV启动子。
& p! ?$ Y% D* B) N$ Q" l7.增强剂和佐剂的应用
7 ?( V) s, Z3 V1 l$ i1 F) Z" `* T       佐剂种类很多。细胞因子基因如TNF、GM－CSF、IFN以及IL－2、IL－4和IL－12等，在与核酸疫苗共同接种时，常能明显提高体液和细胞免疫反应。例如与艾滋病病毒（HIV－l）DNA共同接种的TNF和IL－2基因就能显著加强细胞毒性反应。Weiner等用包含CpG序列的DNA作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，免疫后小鼠能抵抗攻毒试验，且CpG佐剂的毒性比完全福氏佐剂低得多。最近，Rodriguez等利用泛素佐剂将淋巴细胞腺络丛脑炎病毒的核心蛋白（NP）泛素化。泛素化的抗原被快速降解。NP在胞内的快速降解使它不能诱导产生体液免疫。但却提高了它 被MHC-I类分子识别提呈的几率，从而大大提高了CTL的活性。但是，细胞因子基因在与疫苗DNA共接种时，并不必然产生免疫促进作用，不同的细胞因子经常产生不同的效果，甚至有负面效应产生。此外，抗肿瘤调节剂Ubenimix（UBX）以及阳离子脂质体免疫刺激剂单磷酸脂（MPL）乃至一些多肽、包括乙肝表面抗原等，也都曾作为佐剂用于核酸疫苗，并取得了较好的效果。
  I8 z  |3 j8 u" x2 [" v  a8.凋亡信号分子
: l& ]) j0 q$ [4 V1 b       Shin sasaki等将凋亡信号分子（Capase1 DNA）做简单的突变，减慢凋亡的速度，并把此分子与血红球凝集素和淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白（NP）DNA疫苗共表达。结果发现，细胞免疫显著增强。3 x' l) O9 a0 _5 F$ e& ?
9.实验动物年龄和品系的影响  . I5 W$ c: f! x& r
       许多研究表明，幼龄动物接种DNA时，在体内表达水平较高，并产生较好的免疫应答。而且，核酸疫苗不受母源抗体的抑制，在新生动物和婴儿的感染防治上具有广阔的应用前景。动物基因型不同，免疫应答的强度也有所不同，实验证明，BALB／C品系小鼠和C57BL／6品系小鼠在同样条件下进行核酸疫苗接种，却呈现不同的免疫反应。

DNA疫苗的优点及存在的问题
( Q: o# c' O: u& w% a4 O

' e- ^4 n0 y1 G2 v9 o0 E
优点：
: {) W8 X# E' d% [8 x6 Q0 C+ f: n! N       1) 消除导入可能与"减毒"疫苗相关的强毒力病毒的危险性。+ t2 ^+ E, U5 j6 w% y  A9 b
       2) 多个病原体的基因可装在同一个质粒上，减少了疫时多次注射的不适。8 K) K  X% i: `- U/ l
       3) DNA可以干粉形式保存数年，且仍保持起活性。' J: `; H3 a3 `: Q& d
       4) 质粒载体的免疫原性，不会引发针对载体的免疫反应，因而可重复使用或联合使用。& S, ]0 H+ z; h; [" r0 H, b
       5) 核酸疫苗既可刺激机体产生体液免疫，又可诱导产生细胞免疫，对于慢性病毒性感染等主要依靠细胞免疫的疾病的预防也就更加有效。
0 N- C0 W+ |/ k; h, q: H       6) 核酸疫苗可以刺激机体产生比较持久的免疫反应，包括CTL反应和抗体反应。一次或多次免疫后，这种细胞免疫和体液免疫最长可维持几年之久。
2 L' y4 m$ \' c6 @8 e" T0 Q# F& L       7) 各种核酸疫苗可以进行联合免疫，构成多价或多联疫苗，进行多种疫苗的联合免疫。
/ {1 s; S* @- U- z$ z5 e       8) 核酸疫苗可以反复使用，不存在重组活载体疫苗那样的抗载体排斥现象，也不受母源抗体等原有抗体的干扰，有可能成功地用于幼龄动物乃至新生动物的免疫接种。
' u- ]: {6 u6 u5 `6 {2 J       9) 核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，且提纯方法比较简单，成本低，质量易于控制。8 B: T! H" s  D) J1 }, B
       10) 核酸疫苗的质粒DNA性质稳定，便于保存和运输。
2 V- U1 N: m) i3 X( l  i/ V       11) 可以通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇，对同种异株病毒进行交叉保护。
$ y8 }3 U$ @, D1 C       12) 蛋白质抗原在宿主动物细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力而引发疫病，也不必担心机体对病毒性载体的免疫应答反应和载体对机体的不良影响。
; P1 X: K5 y2 r       13) 核酸疫苗可以诱导免疫功能低下者产生强烈的免疫保护，也可为肿瘤病的防治提供一种有效的途径。
/ T: K/ i( _) ~: @" E% o       14) 核酸疫苗如果只含编码某个抗原决定簇的一段核苷酸序列，那就可以直接用于制备单克隆抗体。; j8 x! q! P9 o& R0 s  O: ~" W. B% N

6 L% e6 D% [0 L9 e  bDNA疫苗存在的问题
+ v* t' F& j  K/ b9 a7 e       基因免疫技术的产生无疑极大地丰富了免疫学的内容，解决了目前制剂存在的诸多问题，展示了其强大的优越性和生命力。但目前在实际应用中，它仍不会代替目前使用的传统疫苗免疫。DNA疫苗尚未得到广泛的应用，除了因为它是一种新事物，不大为人所了解之外，究其原因，首先还是人们对其安全性的顾虑。主要有以下几点；
! J- V" p  o( b3 I4 F2 e- e6 h% C( w! u       （1）核酸疫苗能长期在体内表达，是否会引起机体的过程免疫或产生免疫耐受现象，最终导致机体的免疫抑制；
1 W! Y% z- |2 _8 M; e+ n       （2）外源基因进入机体外会不会与宿主的基因发生整合，导致宿主细胞肿瘤基因发生活化且进入宿主细胞的DNA最终去向不确定；
8 T7 S. \/ t, X( q/ g" _       （3）持续的抗原表达所激起的强烈CTL应答可能对机体其它细胞产生毒性杀伤作用；
- a( @% w3 v' k' r& P! s( Y       （4）DNA接种后会不会引起机体的免疫功能发生紊乱，产生抗DNA抗体；
$ r- c# g4 e9 v. a1 n' Q3 S       （5）目前进行的实验都是以动物为模型，应用于人体后是否出现不良反应。) X, [( D, s$ R
       以上这些都是今后需要重点研究解决的问题。" Y6 E" v2 Q# d

  }4 K( J. S* I- w: ~DNA疫苗的生物安全; p! h. K( P4 [+ c! v
       生物安全（Biosafety）比较全面地可理解为国家安全的组成部分，它是指与生物有关的各种因素对国家、社会、经济、人民健康及生态环境所产生的危害或潜在风险。随着现代生物技术的迅速发展，生物安全问题逐渐成为国际社会关注的热点问题之一。
; G( Y6 L! b0 D' V7 B1 i* {+ _       DNA疫苗的研究为人类战胜难以治疗的肿瘤、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病等提供了新的希望，其发展前景是诱人的。但是DNA疫苗的问世时间较短，有些观点或理论尚未确定，有些现象用目前的理论还解释不清，大多数DNA疫苗处于实验室研究阶段，进入临床试验阶段的只有少数几种。虽然动物模型尚未发现其副作用，但也无足够的依据完全排除理论上可能的危害，因此，DNA疫苗的生物安全不容忽视。
; A2 t+ x; S6 j! ^6 i       DNA疫苗的生物安全问题涉及对接种人或动物的健康、对生态环境的潜在危害。即DNA疫苗不仅要符合常规疫苗的安全性标准，还必须考虑到它对公众健康和生态环境产生的影响。9 u: i* {& r3 J, q) z' i' V
1 对接种对象的安全
% T: l) x# r% U# n4 J7 A（1）质粒DNA有可能整合到宿主染色体基因组DNA上7 X  g" u1 m$ ]; O  ?2 G
       理论上，外源DNA引入体内敏感细胞中可能通过插入活性致癌基因，插入激活宿主细胞原致癌基因或插入灭活抑制基因引起肿瘤细胞形成，当然，注射进动物的DNA只有一小部分分子进入细胞，这一小部分中又只有部分可能进入细胞核，质粒DNA传递系统转染细胞的效率比病毒载体低，估计每1000个转染细胞的质粒分子仅有1个能够达到细胞核并被表达。外源DNA整合进染色体的可能性极低。因此，插入突变的危害性是相当低的。' r! f; h7 X. V7 T: n* N
       Martin应用敏感的方法检测了载有恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的质粒VCL-2510 Sfi（6261bp）在小鼠体内基因组整合情况，结果是在1μg基因组DNA中检测到了1~30个拷贝，相对基因组自发突变的机率1×10-5，这种最坏情况引起的危害性是自发突变危害性的1/3000。Robinson报道了对质粒DNA疫苗接种后小鼠体内肿瘤发生率的长期研究成果，结果表明，用PCR在小鼠发生的多种肿瘤组织（包括腺癌，横纹肌肉瘤，卵巢癌，脾和肝淋巴瘤）中没有检测到质粒DNA。到目前为止，在组织标本中检测质粒DNA时没有发现基因组整合的直接证据，尽管如此，人们仍然对整合存有疑虑。  x. u0 v* b8 S6 q
（2）持续表达外源抗原造成的不良后果
$ h8 |, g2 q1 B' R" }1 O7 z& Q+ Q       长期表达外源抗原可能产生意外的不良后果。理论上的可能性包括免疫耐受、自身免疫病、过敏反应、超免疫力或自身攻击。
1 |* B6 J1 ~0 f3 ?+ ~) h       DNA疫苗表达的抗原在新环境中提呈时，可能不诱导适当的免疫应答，或者更严峻的是有可能诱导免疫耐受，尤其是在长期表达的情况下。牛血清白蛋白（BSA）单独或与佐剂一起接种小鼠具有免疫原性，但小鼠接种经超速离心去处凝聚物的BSA后，不产生体液免疫应答，却产生耐受性。然而，由于免疫耐受的产生与实验动物的种类，年龄以及接种的抗原种类和方法以及接种的剂量有密切关系，因此，DNA疫苗接种产生免疫耐受的危险性是很低的。
! w% k3 }  w. G, X% u& O9 T       如果免疫应答太强，可能出现过度刺激并产生交叉反应性，在严重的情况下可导致自身免疫的产生，也可发生过敏反应。如红斑狼疮那样的自身免疫紊乱中，可以出现特异性高亲和力抗DNA抗体。
* ~1 [. A; F- j6 s       关于DNA疫苗接种引起过敏反应，既有疫苗本身的因素，也有其它杂质（如抗生素，细菌蛋白质等）的因素，因此质粒DNA疫苗的制造应符合生产质量管理规范(GMP)的规定，以减少杂质因素引起的过敏反应。$ K: Q4 X! q3 f
       外源抗原长期表达，低水平分泌的免疫原可能持续被低水平抗体清除，导致免疫应答不足；长期高水平表达，可诱导超免疫性，使个体免疫抑制，容易受到病原体感染；由于CTL导致表达细胞和周围细胞的破坏，可能发生自身攻击。
% G* I' J) D8 Y# `/ W* E2 对生态环境的安全. z9 l3 W" b" p, x! |
       DNA疫苗对生态环境的潜在威胁，主要涉及质粒DNA被摄入机体后是否发生基因残留和转移。这包括：在体内是否会转化到动物体内（如肠道）存在的菌群中，从而会引起基因的扩散；能否水平转移至肠道微生物或上皮细胞，从而对机体产生不利影响；或者在没有完全代谢的情况下，会以原型形式排放到环境中，或转化环境中的菌群，或造成其它形式的基因污染。特别是E.Coil表达系统常含一个编码抗生素的基因（如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素），抗性被用来筛选转化子及使细胞能携带治疗性基因到达靶区。抗生素抗性标志的存在可能会在将来引起安全机构的关注。抗生素标记基因是否会转移，从而降低抗生素在临床上的有效性。我国已制订了《农业基因工程安全管理实施办法》，对农业基因工程产品的试验研究、中间试制、环境释放等做出了具体要求，农业部转基因生物安全管理办公室每年定期对转基因产品进行安全性评价，保证了动物DNA疫苗研究的规范化，能够更深入地掌握DNA疫苗及安全性问题。

DNA疫苗研究进展
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1．流感DNA疫苗   
! P# Z4 X8 Z) c# r       1993年，Ulmer等首先报道了用基因免疫可以防治流感病毒。他们将A／PR／8／34流感株（H1 N1  ）NP编码基因山NA插入质粒载体中，构成表达NP的质粒，免疫小鼠后不仅对同林流感病毒有抵抗力，而且获得了对A／HongKong／68（H1 N1株）的保护性免疫。1994年，Webster等以雪貂为模型，注射质粒pCMV／H1后获得抵抗同种病毒攻击的保护作用。& o) L' S8 [7 B+ _
2．艾滋病DNA疫苗   
* {' c4 k, ]9 i& ~       艾滋病DNA疫苗从1993年 Davis等首先将编码HIV－l胞膜糖蛋白基因的CDNA重组质粒 PMI 60接种小鼠后，促使肌�