生物素-亲和素系统

& T9 e/ k6 }' v' E% }0 z; ]主要内容：; Q. b) ?: j4 y  x7 p6 a( A4 u% G
1.生物素-亲合素系统原理
% S( E' K8 z- ]: n2 O1 Y2.生物素-亲和素系统的特点
& F- }4 Z( I- X$ A/ Q3.生物素-亲和素系统实验试剂
; {( {8 T% ^: h( t* o6 Y1 @/ Y; V4.生物素-亲和素系统实验步骤
$ M9 ?; h" v3 e2 \  z: P5.生物素-亲和素系统之亲和素标记: a. h0 ~8 p* a
6.生物素-亲和素系统之链霉素标记
; u0 Y- M% S- s& F7.生物素-亲和素系统生物素及其活化
  {2 E- y1 u3 j. s5 w# p8.生物素-亲和素系统标记抗体注意事项
- @- m' N, Y) }0 I; o9.生物素-亲和素系统的应用
0 _" D) S/ l; `" I3 P8 U: `4 C: W( T4 t
2 j$ f; z) A: \5 Y5 ~声明：
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# l- J# S$ F* d) t: @$ t; f致谢：) Q6 c) O! ]) R5 `! q
整理者：microfox    审改者：wny7 p/ H; I7 n) _; ?7 ~$ H  M: W
主要参考资料：
3 V7 I+ k4 }5 d6 B《精编分子生物学实验指南》 颜子颖" b& r: K1 Q* S8 r0 p5 G
《免疫组织化学实验技术及应用》倪灿荣 马大烈 戴益民

生物素-亲合素系统原理

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7 {$ t/ ]6 y4 x& B1 g" Y! l    生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。分子式C10H16O3N2S，分子量244.31难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)，PH=3.5，羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）。亲和素是一种存在于卵清中的碱性糖蛋白， 一个亲和素分子可与4个生物素分子稳定结合。亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素--生物素标记法(Labeled avidinbiotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidinbiotin, BAB)和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxid ase complex，ABC)。' s& X3 U6 l4 b3 M- s9 W. `7 X( ]
    生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。! f, v8 K+ O$ n
    BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据BAS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。为节省篇幅，兹只介绍BAELISA法。7 f  o1 ~6 V% R" B; F7 H. S) n
原理% A$ V8 K  L) w- M  D  N$ @4 p8 s
    BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。- `& O; `/ W2 p8 a
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链霉亲和素及其活性5 Y; p+ z" x9 L! g5 m
    链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。  Q3 l0 E, Q7 F( W8 E) |6 _$ H' C
    链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mol。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。* {& V: e4 `9 h5 S

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生物素-亲和素系统的特点

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    生物素（biontin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31kD．生物素分子有两个环状结构（图 11-1），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要郎部位；II环为噻吩环，Ｃ２上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（图1）。亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pＩ=１０.５；耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（K）为1015Ｌ／mol，比抗原与抗体间的亲和力（K＝10.5～11L／mol）至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。亲和索以结合１μg生物素所需的量作为其活性单位，1mg纯的亲和素的活性约为13—15U。
7 u4 y0 }) F6 o% @% u4 e3 k    因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面。1 s& V0 d' {' N
       1.灵敏度
5 `$ K- Q9 c/ {; ~7 w3 C( J    生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。 . S9 X/ Y8 d: m5 s' P2 l' }
       2.特异性
/ {$ u5 K: X# L' d, b, @; Z+ q    亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
6 d$ X# Q3 O! N0 F+ n; d; `       3.稳定性
3 \# `/ K2 d% k+ M: B    亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度，
' W  w3 A4 @+ F0 Z7 ~       4.适用性( I: ~. ]% Z% ]/ n5 P7 \/ i! D" {
    生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。此外，多种BAS的商品化试剂，为临床检测和科研工作提供了有利条件。0 p8 @8 m  s- O' v
       5.其他
7 O% d3 O5 e+ t2 K    BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等）适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用．此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成．) a1 D( X6 z2 p, d5 z

! @4 h% o5 @( _8 B0 g[ 本帖最后由 microfox 于 07-8-17 17:58 编辑 ]

生物素-亲和素系统实验试剂

: a, P0 M$ D/ B: z1.生物素化抗体：可根据需要从生物制品所购买，也可以自制。本室制备生物素化抗体的程序是：用0.1M NaHCO3溶液将纯化的抗体稀释为1mg/ml，将生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS，国内有售)用二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，在1ml抗体溶液中加入BNHS液20μl，混匀后置室温(22℃)反应2小时，然后在4℃中对PBS透析2小时，滴定工作浓度后即可使用。
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2.酶标记的亲和素：一般生物制品研究所均有销售，可按其说明书进行稀释及使用。如果自行制备，可采用Wilson的过碘酸钠标记法，详见酶标记抗体部分。
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# c0 W$ f7 Z( J3.抗原、抗体和参考血清等。( ~/ N) X2 V9 G& u/ ?3 a2 ?
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4.其它的试剂和器材可参考ELISA部分。
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生物素-亲和素系统实验步骤
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方法一　用于检测未知抗原的BA-ELISA:# m/ f2 v* x- N; h- B
       1. 包被抗体：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。
5 A- m2 v3 j. z9 S  u       2. 加样：加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37℃孵育１小时，洗涤。: r" c* k3 J+ i! g" }  k
       3. 加B-Ab：已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab)，加于每孔0.1ml,37℃孵育30～60分钟。洗涤。
+ g! \+ Y; s) o: E. w0 A       4. 加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP)，于每孔加0.1ml，37℃孵育30～45分钟。洗涤4次。
, s; z- B8 l' M       5. 底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或OPD)底物应用液0.1ml，于37℃10～30分钟。再加2M H2SO4 0.05ml以终止反应。
4 G( C& |8 Q7 D1 w" \/ E       6. 结果判定：目测或在ELISA比色仪上测OD值。/ y$ Y8 ?- Z0 T' o
　
1 B- x8 M/ k9 G+ [2 n+ h/ _! k0 z方法二　检测未知抗体的BA-ELISA程序:0 p" }% _2 l& L* a$ e. ]
       1. 包被抗原：用0.05M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，) X% c7 k) f) r' j' P5 p
       2. 于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1ml，4℃18-24小时。用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
' O; A5 _+ p3 T       3. 加样：加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗涤。
8 {; r/ v* }! z% o# E6 L       4. 加B-Ab2：加稀释过的生物素化抗抗体(抗人或鼠等的IgG)，每孔0.1ml, 37℃30-60分钟，洗涤。+ u& p/ ^7 C- c
　　余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。) J8 e  l+ p1 \& N) O0 M
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生物素-亲和素系统之亲和素标记
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       几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素（AV）或链霉亲合素（SA）结合。小分子的有125I、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质有酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金．
5 D, b$ F" R& [       亲和素或链霉亲和素均为大分子蛋白，其与酶的标记结合物的制备除可用普通酶标记蛋质分子的直接标记法外．由于其特有的与生物素结合的性能，还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。: b. I) l) f5 G& l3 G
       以下举例介绍几种制备亲和素（或链霉亲和素）与常用酶形成标记结合物的方法。1 A# O% k! M8 v2 x" P( e, k
1．亲和素的标记& K5 M. E% b) b! u1 j0 a
       （1） HRP-亲和素结合物的制备; `' {4 W) X. Z$ _! K& G1 F
       1）改良过碘酸钠法：新配制的HRP溶液中加入过碘酸钠（NaIO4），将酶分子上的糖基氧化成醛基；依次用醋酸盐溶液（pH4.5—5）和碳酸盐缓冲液（pH9.0）透析，然后在HRP醛基溶液中滴加亲和素搅拌反应，HRP的醛基即可与亲和素的氨基共价结合；加入硼氢化钠（NaBH4）终止反应，再透析、离心去沉淀，上清液即含HRP-AV结合物：9 w) F2 B  ^. O7 g& x
       2）戊二醛法：用新配制的HRP与亲和素溶液充分混匀，加双功能交联剂戊二醛室温反应，后者的二个醛基分别与HRP和亲和素分子中的氨基形成Schiff's，碱使二者连接，经充分透析去掉未反应戊二醛，再离心去沉淀等杂质，收集上清液（含HRP-AV结合物）。0 e  D* C3 p/ P; j! k
       （2） 亲和素-生物素化HRP复合物的制备：
4 s1 U4 r* v" l0 c8 D. E, U       利用亲和素与生物素间特异的结合，将亲和素与等体积的生物素化酶（HRP－B）按一定浓度比例混合反应后，亲和素即与HRP-B中的生物素结合，形成亲和素—生物素化HRP复合物（avidin-biotin-peroxidase complex，ABC）。5 O. O- y2 N: c' }. A+ e) L% R
       制备ABC复合物时应注意，亲和素和HRP-B的浓度应控制不高于40μg／ml和10μg／ml，否则将增加非特异反应。. @0 s& M- i) I1 `1 G8 U& t
       （3） 亲和素-生物素化碱性磷酸酶（avidin－biotinylated—alkaline phosphatase，ABAP）复合物的制备:将亲和素溶液与生物素化AP按4:l（浓度比）比例混合反应（至少十分钟）后即可制得ABAP复合物。0 k0 L* N* f" J4 l" }
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生物素-亲和素系统之链霉素标记

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链霉亲和素的标记/ L, G; u8 b$ o7 w$ v
       链霉亲和索（SA）因表面所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素，因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用。
0 `2 Q( k  ?& q4 d$ Q% ]       （1） HRP-SA结合物的制备　
8 B6 }6 Y- R$ c" g" ~3 a       采用过碘酸钠直接标记：反应在４℃进行，先在HRP中加入NaIO4，然后直接加链霉亲和素溶液混匀，再用碳酸盐缓冲液（ＰＨ9.0）透析后，用KBH4终止反应：加饱和硫酸铵沉淀，离心后弃上清液，再用PBS复溶沉淀即得HRP-SA结合物．
& w! E% w6 d6 `6 C; H       （2） SA－生物素化HRP复合物的制备　
$ V% l+ [/ f( D. P2 U1 b       按BNHS标记抗体法制备生物素化HRP（HRP-Ｂ），再将HRP-Ｂ适当稀释后，加入等体积的链霉亲和素溶液（HRP-Ｂ与SA浓度比约１：４）反应，即可制得SA－生物素化酶复合物（streptavidin-biotin-peroxidaes complex，SABC）.
2 J  Q5 V" T  `6 _0 |       （3） ＡP-SA结合物的制备　7 O- j, I/ Q0 s+ \) J: c
       采用戊二醛二步法：先用饱和硫酸铵沉淀碱性磷酸酶，离心后加过量戊二醛溶液复溶碱性磷酸酶沉诧．戊二醛的一个醛基即与碱性磷酸醇的氨基结合：充分透析除去未结合戊二醛后，加链霉亲和素与结合了碱性磷酸酶的戊二醛另一个醛基结合，用赖氨酸终止反应，离心后留取含AP-SA结合物上清液备用。
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生物素-亲和素系统生物素及其活化& g. F: B( r+ W( v/ B: r, Y) `3 o7 c' V

0 W) N6 l" S/ R, m/ M$ h8 n       生物素经活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。目前已有商品生物素标记试剂出售，使BAS放大系统得以广泛地应用于免疫化学、分子生物学及生物化学等领域的分析测定技术。7 o  v( x* p* {3 z" }
       以下介绍几种常用于标记不同类型生物大分子的活化生物索的制备及特性
1 T5 q1 l4 j5 i" F1 L0 Z  N       1．标记蛋白质氨基的活化生物素
' L6 _2 k$ Q/ _       2．标记蛋白质醛基的活化生物素 , A! m$ m& S+ f3 H8 E' p8 }
       3．标记蛋白质巯基的活化生物素) x) I" C) l# r# E3 o6 h9 _0 T
（1） 标记蛋白质氨基的活化生物素" h. s( y' z4 H; P* b6 F0 g% ]- H
       此种活化生物素的制备方法是将生物素与Ｎ－羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物索素Ｎ－羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基团可与蛋白质分于中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点PI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。
& C0 Z+ ?2 H' c7 j; c+ @       生物素的分于量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后．由于大分子蛋白的空间位阻效应（steric hindrance），可对生物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果造成干扰。可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。" q' c4 Q$ c' H6 R9 ~# H
       长臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基己糖分子基团，形成连结臂，使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响，更易发挥生物索的活性作用。BCNHS的制备是先用6－氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，然后再将其活化。
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（2） 标记蛋白质醛基的活化生物素
! f$ b$ }' }7 M- J1 A       用于此类标记的活化生物素有两种：生物衰酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）。BHZ是水合肼（hydraine hydrate）与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。也可在BHZ侧链上添加一个赖氨酸基团作为连结臂，减少标记后的空间位阻，使活化后的生物素能更好地与亲和素结合。3 C& i: _. n; s9 F6 j8 \0 [3 j' a
       生物胞素（biocytin）是生物素通过-C=O基与赖氨酸的ε－氨基连接而成的化合物，它与无水肼反应后形成的肼化物即为肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可与蛋白质的醛基结合外，它还与BNHS相同，能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。

（3） 标记蛋白质巯基的活化生物素
) f2 V' c  I7 p  E2 n       3—(N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素[3-(N-maleimido-propiny）-biocytin，MPB]是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。它是用氯化生物胞素与3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反应后制得的。
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生物素-亲和素系统标记抗体注意事项

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       1. 反应物的浓度及比例：由于本法敏感性很高，所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体(或第二抗体)的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
3 k  o# A' k. z0 D" Y* }       2. 生物素的稳定性：生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60％甘油于-20℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。1 D" D- c' \5 q
       3. 亲和素的稳定性：亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4℃置2个月或在-30℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
7 \" `! _( Y# J4 C  s5 P       4. 亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
, {. P1 h, U% o2 H, R       5. 反应物的作用时间及温度：由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37℃以20-30分钟为宜。

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[ 本帖最后由 microfox 于 07-8-17 17:59 编辑 ]

生物素—亲和素系统的应用
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4 ]" M- b8 o0 U7 M4 K       BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测，用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫—PCR（immuno-PCR）用于抗原的检测等三方面。现简介如下：
: G+ Z2 t: M2 o+ J$ P  u/ N1 k$ G       自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷（dUTP）和UTP等核苷酸单体以来，以生物素化多核苷酸为探针的核酸杂交技术有了很大发展。生物素标记核酸探针常用于Southern、Northern和原位杂交等。实验时，标记探针先与细胞或染色体原位（或是固定在乙酸纤维素膜上）的变形核酸分子进行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素（或链霉亲和素）识别杂交互补片段．使其显色或产生荧光。这种非放射性标记技术具有灵敏、安全。简便快速和经济的特点，并且克服了放射性核索探针标记与检测的缺点，应用潜力巨大。
9 k- ^: ]- B' q* f. r. l8 e1 k       利用BAS与磁化微球技术联合进行mRNA的分离和提纯：先用生物素标记的寡脱氧胸腺嘧啶核苷酸[Oligo（dT）]和总RNA杂交，再用包被链霉亲和素的磁珠捕获mRNA，经磁性吸附，将mRNA—磁珠混合物一并分离，然后将分离的mRNA洗脱收集。这种生物磁珠分离法较传统的用带Oligo（dT）的纤维素或琼脂糖亲和层析分离法更加有效、方便。# C) I! U" H9 Z; x3 ?
       免疫-PCR是将抗原－抗体反应的高度特异性与PCR技术的高度敏感性相结合建立的迄今最敏感的分析方法，其检测灵敏度可达10-21ml水平，免疫-PCR的技术关键在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA间建立对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。如用链霉亲和素（SA）-蛋白A嵌合体作为连接分子，它的蛋白A和SA可分别与IgＧ的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立起对应关系，经PCR扩增，即可将抗原抗体反应的特异性高度放大。此外，为解决传统PCR扩增产物检测方法操作繁琐、灵敏度低和耗时的不足，现又有用ELISA方法来定量检测，免疫-PCR扩增产物，称为PCR-ELISA。它主要是用一对分别标记了生物素和地高辛的引物来扩增标记DNA，亲和素则作为捕获抗体以固定扩增产物，再用标记有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA检测扩增产物。结果显示，此种方法的测定灵敏度、精密度和稳定性均优于传统方法，而且PCR-ELISA更节省时间和更易于临床检测的自动化。
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+ s- J) y& K& t5 u, h- o5 R1 a* t1. 生物素—亲和素系统在ELISA中的应用 % i( V7 S4 B* L7 s$ ~0 B
       把BAS与ELISA偶联起来，可大大提高ELISA测定的灵敏度．因为亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；每个亲和素可结合４个生物素，可使反应明显放大；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。
' ~6 O& @* }8 H, N       BAS与ELISA偶联应用的形式有多种：如用于固相化抗体或抗原的制备．即是先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素—生物素反应而使生物隶化的抗体或抗原固相化：这种包被法不仅可增加固相载体上的抗体或抗原包被量，而且使其结合位点充分暴露，有利于免疫反应的有效进行。BAS亦可用于ELISA终反应的放大：用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。下图所示的即是一种BAB反应模式的BAS应用于双抗体夹心法ELISA检测抗原的原理及过程。
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2. 生物素-亲和素系统在均相璃免疫测定中的应用
7 a$ u2 I* e2 o       BAS除了作为免疫测定的放大系统外，还可作为均相酶免疫测定（HEI）中高效的酶活性调变系统。在BAS—HEI系统中，预先将作为配体的生物素与酶偶联，形成的生物素－酶复合物具有完整的酶活性；亲和素作为特异的酶结合体（类似于抗体），可与生物素-酶复合物结合。经典的抗体结合酶抑制性均相酶免疫分析类似，当生物素-酶复合物与亲和素结合后，酶活性中心受空间位阻作用而失活． HEI为竞争性结合反应，因此反应系统中，同时加行生物素－酶，亲和素-抗原，特异性抗体和待测抗原：由于抗体限量，于是待测抗原和亲和素-抗原复和物竞争与抗体结合。亲和素—抗原与抗体结合后．即不能与生物素-酶复合物结合，后者的酶活性得以保留；而游离的亲和素—抗原则可结合生物素－酶复合物，井使后者酶活性丧失。因此．反应体系中待测抗原浓度越高，则游离的亲和素-抗原复合物越多，最终测得的酶活性越低，即酶活性的变化与待测标本中抗原浓度呈剂量相关。# e+ q4 h/ Q, D% }& ?

% W/ ^; X0 n# O! e3. 生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用
( s* ~& v, T* M       荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）是发展最早的一种标记免疫技术。FIA按实际用途可分为两大类：一种是经典的以荧光物质标记抗体，主要用于组织和细胞中抗原、抗体的定位观测，称之为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）；另一类则是用于液体样本中微物质定量的荧光免疫分析技术，如时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）或荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay FHA）等。' L. G2 K$ W) X8 k
       BAS用于荧光抗体技术．通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素（或链霉亲和素）；也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法。与常规荧光抗体法相比，引入BAS的荧光抗体技术可明显地提高方法的灵敏度和特异性。9 G2 o3 F7 Y! u7 m5 C! l* ?
       TRFIA发展至今已有几种分析体系，其中与传统的解离增强镧系元素荧光免疫分析（disso-ciation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay ，DELFIA）不同，Cyber Fluor时间分辨荧光免疫分析（Cyber Fluor time-resolved fluoroimmunoassay ，TRFIA）和酶放大时间分辨荧光免疫分析（enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA）均将BAS引入反应测定过程，利用其特异的生物放大功能，提高测定的灵敏度：现以双位点夹心法实验为例，简介其工作原理如下：
, D- ~6 \9 S( b  L9 T6 {       Cyber　Fluor　TRFIA采用的是一种新型双功能螯合剂，称为4,7-双(氯碱酰基苯基)-l,10-菲咯啉-2,9-二羧酸[4,７-bis（chlorosulfophenyl）-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid，BCPDA].用BCPDA做“桥”，一端连接链霉亲和素（SA）。另一端螯合Eu3+；制成通用试剂SA-BCPDA-Eu3+；此外，将两株ＭcAb分别固相化和生物素化。反应完成后形成的复合物为：固相McAb-Ag-（McAb-生物素）-（SA-BCPDA- Eu3+），即通过生物素与链霉亲和素间高亲和力的结合，把通用试剂与固相载体上的双抗体夹心免疫复合物相连接，并且特反应信号放大。9 r* }: P( f8 s/ ~, i  L
    EATRFIA则是在抗原与固相McAb和生物素化McAb反应形成夹心复合物后，加入碱性磷酸酶（ALP）标记的SA（ALP-SA）继续反应，经生物素和SA的高亲和力结合，形成复合物：固相McAb-Ag-（McAb-生物素化）-（SＡ-ALP）。ALP再作用底物生成产物5-氟水杨酸，后者在碱性条件下，可与Tb3+-EDTA形成荧光寿命长且产额高的三元复合物用于检测。EATRFIA是汇集了酶放大作用，BAS的高亲和力和生物放大作用以及TRFIA优点的新一代高灵敏度、不用增强液的分析方法．
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! R/ C( E( u" ~* [) C* B+ ?) d4. 生物索-亲和素系统在放射免疫测定中的应用
* `$ [1 ]* l  S) V) P! C5 `0 e       BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原（标准抗原和待测抗体）同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物；再加入125I标记的亲和素（或链霉亲和素）与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，进一步提高IRMA的灵敏度。如该系统用于测定促甲状腺激素（TSH）时，由于方法的高灵敏性，即可将甲亢患者降低的TSH水平与正常值低限有效地予以区别。此外，BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离：先将生物素化的McAb和放射性核素标记的McAb与抗原的不同抗原决定簇结合，反应平衡后，加入表面偶联有亲和素的聚苯乙烯珠与免疫复合物中的生物素连接成固相终产物。该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦．待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。