免疫PCR(Im-PCR)

/ ^  V2 |6 v% H4 M" x主要内容：  Q- q# ~8 R& y; x3 U& a/ y* c8 B
1.免疫PCR基本原理5 B- ^- Q4 ~; b/ z5 v2 g
2.免疫PCR的种类4 _2 c' I2 Y' Q
3.免疫PCR基本实验步骤
" G( W& i1 A( q; V2 A" V4.免疫PCR产物检测及定量技术
: }9 {7 e, e! Z  z& o3 ^5.免疫PCR要点
% t4 y5 c) O% k/ S0 L: p: b! \6.免疫PCR优化策略及改进9 V! R% N) ^+ Q6 c
7.免疫PCR注意事项* r4 C: X0 @1 k2 X/ p5 v- h
8.免疫PCR的应用及发展# r9 a5 {. H' Z- Y+ H

2 ^& f; B& N% |* B声明：6 c# x  O# l5 k& x; ~' H
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致谢：
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. Z( Z) O; V3 U+ E. u) n0 q主要参考资料：
0 f' V. Y) x) p" q《免疫PCR方法的研究进展》  中国人民解放军第253医院免疫中心  额尔敦 郭美香 $ M+ j5 @: M: [7 T" R& Q
《免疫-PCR技术进展》   南京铁道医学院生物学教研室 洪泽辉 张丽珊+ j  v" f3 u6 j) s
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免疫PCR基本原理

/ E8 D( N3 ]. \; A
1．定义
# O  \9 i4 {6 J6 N8 N: a8 l2 H* U    免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。
4 f8 ^& e4 \3 `8 p8 r    用抗体检测抗原是免疫学的最基本方法，用酶或同位素标记抗体可使检测的敏感性提高，常用的定量检测方法ELISA和RIA均基于标记分子可以使检测的信号增强。免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
- a$ c* t4 z8 w1 a* f3 v2．基本原理
# W6 W/ }+ Z7 g1 ?    免疫PCR是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针，用此探针与待测抗原反应，PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法，理论上可以检测单个抗原分子，但实践中它的敏感性受许多因素的影响，如连接分子、显示系统的选择、DNA报告分子的浓度、PCR循环次数等。目前，国内外报道免疫PCR的敏感性一般比现行的ELISA法高102～108倍。由于PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比，因此免疫PCR还可用于抗原的半定量试验。
# z. J( a6 _( h! E: H5 w    免疫PCR主要由两个部分组成：' ~" W( U7 C9 y0 m9 m2 U
    第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;
7 D# V) J6 {7 L- W9 `$ D    第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。2 w7 n% o- }2 t% l. I' Q' S& z0 d
    第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(Protein A-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。6 D% P2 ?) z% p9 E
    接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。* q5 r+ A: h( Q! }, `
    PCR由①待测抗原；②生物素化抗体；③亲和素（连接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR扩增五部分构成。
9 i8 Z. x- M& A（1）待检抗原( ~1 d$ b; V3 t$ s, {* q( x
    被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相，这一过程与ELISA试验是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测，需要对免疫PCR进行改进，以便能够检测吸附性差的抗原。免疫PCR的后续过程需PCR扩增，目前有些方法应用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR仅可以直接用微量板进行扩增，这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特别适用于检测微量抗原。
) V7 D3 J6 U  b% J+ R2 c（2）特异抗体
7 q$ i/ M8 Q8 M# ?7 V    免疫PCR中的特异抗体是对应于待检抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲合力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和素再结合DNA。9 I- M8 O. J- z8 m5 r% W7 A6 E
（3）连接分子4 I- }7 {: e4 T
    连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白(SPA-亲和素)。其具有结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR，这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物，然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此在预结合时生物素化的DNA分子不能过多，否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力;但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均有差异，从而导致重复性差。
2 D6 P$ B" p$ W; I. k3 s2 W7 F    Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链亲和素，在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入，这样链亲和素先与生物素化抗体结合，冲洗后，再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。! `, Q* F3 B' W. y. s) _1 x/ ^" e
（4）DNA和PCR系统
; a5 j& {2 k1 x( D    免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是一个分子DNA标记两个生物素，标记率可达百分之百。生物素化的DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。" Z! V  q7 p& o
    免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。! P5 u" ~+ ]8 L) C% H

$ Q3 o8 R9 |* i8 |3 o2 u[ 本帖最后由 microfox 于 07-8-12 17:17 编辑 ]

免疫PCR的种类

6 l: N. ]4 n. t6 S  g- Q% n
（1）原位免疫PCR（in situ immuno,PCR）  : n0 j0 s  Y& e6 Q: D
        原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，是一种原位检测组织或细胞中抗原的技术。它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。' u  y1 u2 R/ g$ t9 f4 r9 o. p2 y
原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。
4 E, c$ |2 n: K! @: D4 j        其基本方法为. A, S' O: @! K0 X% ^& J  q2 R2 `
        ① 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。1 \4 o- ]3 Y% M# M
        ②蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。
! g6 u0 k% A! Y- ?        ③PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。  `8 Q- ]( q/ D
        ④杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。: z) R- U% `* u9 y9 ]
        ⑤显微镜观察结果。4 \/ m& g* w! x/ g( s. L
        待检石蜡切片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性DNA和RNA经核酶充分消化后，通过生物素化单抗与亲和素系统的桥联，将生物素化的DNA报告分子固定在石蜡切片上，进行原位PCR扩增，扩增产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是否存在。Cao用原位免疫PCR检测肝石蜡切片上的乙肝表面抗原（HBsAg），其敏感性较免疫组化法显著提高。0 [- D4 l- T) ~& Z  z5 w8 T
        原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.
3 y; {; i* q3 U# `. ?（2）细胞免疫PCR（cellular immuno，PCR）  2 ]4 u/ }7 c3 n+ C- W7 q& B
        通常用来检测细胞表面膜抗原。Zhang用此法成功的检测了白血病病人血清中转移癌细胞上的肿瘤抗原GM3。首先用抗CM3单抗制备单抗-亲和素-生物素化复合体，然后分离病人外周血淋巴细胞，充分洗涤封闭后，与单抗DNA复合体共育，洗涤后抽提细胞总DNA，利用DNA报告分子的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经Southern blot显示结果，病人外周血淋巴细胞可扩增出300bp的特异性条带，正常人无。+ C4 d( e2 M& K  V  V
（3）多分析物免疫PCR  
9 E9 L: Q1 B- {6 ~  ^4 K$ h        利用大小不同的DNA分子标记不同的抗体，可同时检测多种抗原。Joerger用99个碱基的DNA分子标记hCG抗体，用88个碱基的DNA分子标记hT-SH抗体，同时检测hCG、hTSH两个分析物，两个DNA报告分子共用一对引物，但PCR产物的分子量不同，从而使两个抗原得以鉴别。# G1 M, `9 B) c2 U% L
（4）单引物免疫PCR  ' o) R& o& I; U9 h8 C
        即DNA报告分子的两侧累含有相同的引物序列，可用单引物进行PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适合于多分析物免疫PCR。

免疫PCR基本实验步骤

  d, Z1 ]. }% p主要程序
* \- I) _+ B  `0 S6 `8 X' ^' B       （1） 抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
" z/ g/ X; ]' `3 [5 ~       （2） 加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；" r( J* H# D4 d) G
       （3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；* G: k7 ?7 e7 O+ h$ M( x
       （4） PCR扩增生物素化DNA部分。/ s6 e  ]& N; }. f. g5 G% G
实验步骤4 V- J0 U% J* C! p! G
       （1）制备生物素化DNA; M* I3 S: f' c3 R) f
       将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即为生物素化DNA。, U. i, r; t; L' H9 |8 b5 \  a
       （2）免疫PCR模式
& I( K) U& ?& y- E' B5 y1 M. p1 试剂 . W- X! X2 k$ {, L3 {2 U
       包被缓冲液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;1 K) \; z' l% f
       洗涤液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;' q  ^2 c6 @! D0 g$ \! w, |2 u
       稀释液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml), y1 F  v; M, U9 b: E7 A, i; q6 Y
2 操作
& v( Z7 U: Y1 T$ v' N2 m9 Y& o- R; F       （1） 包被
( T7 u: ^) V9 `9 G       用包被缓冲液稀释抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃过夜(约15h)，用洗涤液洗板3次×5min。
8 f8 X: `' T) r1 e4 v3 n       （2） 封闭:$ d' ~+ X) K$ e2 s+ y
       每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
/ q9 D) ^% ]  }1 z" J       （3） 抗原抗体反应:3 e0 X3 H/ K  Y, v/ a. U
       用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。# Q# f1 c% `* X& w% q
       （4） 链亲合一蛋白A结合反应:. L; E1 M. `" m4 i& i& J* O
       每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温(～22℃)50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。* ^) u& e0 g9 x* [2 U' r: k$ e4 r
       （5） PCR
6 `7 Y. @' d* L7 Y+ B* W       实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明胶(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每种0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。9 i% y& [. d7 ]7 h+ p' y; x2 V* s
       PCR周期 PCR前，用紫外线(UV)(254nm)照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5min;30个周期:变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。- P1 d! A* }- c& ~" ]" }
参考流程# W& M0 i/ j5 z3 e; _5 M" {0 a' A
       1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。 6 V6 u6 g! \' c7 [& r
       2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。   
) L. J+ e  R! g* I8 p# l1 j       3. 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。 ( J% ^, N' `$ U" b+ P# X
       4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时.
3 M* s7 }( ]& I& ^7 `0 \       5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.  # D' E" E, |; |$ p
       6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30min.  ; L- X0 x8 O/ }# S5 D
       7. 用TPBS洗涤五次.   
7 y1 r4 P1 U8 |" s       8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30min.  + \/ e. m( M/ }
       9. 用TPBS洗涤五次.   
- f( i0 `7 M! w$ l3 y3 c5 L       10. 加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30min.  0 n! A! p- m7 `7 N
       11. 用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次.    ) \3 p- H( L5 Q) g  c  s1 o
       12. PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照像,进行定量分析.

免疫PCR产物检测及定量技术- l) a  Q4 {( o+ X" W) A

! h9 F( s' m" P) `9 L" [（1） 凝胶检测系统  
, O+ E! Q: m1 `       用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
. X. V; T, {9 l  {+ o3 B1 b6 `/ m（2） HPLC检测系统  ) V7 L  L- N$ C& b. j5 Z
       此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。! a7 r6 U+ [- A6 j. u
（3） 固相测定系统  7 q& x, H2 G0 t$ {
       最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为:双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体:AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
. l) ?* n. B1 G5 z+ l. D$ x（4） SPA(Scintillation Proximity Assay)系统  
9 |' {. o$ V6 k' d6 Z% o6 D- h       用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。  A' h6 `; ^/ c
（5） 点杂交检测系统  ! ~8 E6 f& W* y' W: \3 n$ x5 K+ C
       将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T)尾巴固定于膜上，与变性后的已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲合素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
4 M, b* b5 X* O3 l8 D9 n* [2 n（6） 电化学发光检测系统  6 M5 s) o0 a1 r6 G5 p. `* J
       通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物(TBR)标记的探针杂交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。6 O  |. f* v+ s6 D- M$ F# q$ W. ?
（7） DNA酶免疫测定系统  % o+ J$ N: z" j
       通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。3 R& v% d5 E+ B$ V' _  J  h4 j: i9 d
（8） 激光诱导荧光检测法  + ^  s0 V# g) A
       首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。- D  [5 o' F# \5 c0 c
       总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题，目前多用于研究，但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。

免疫PCR要点7 ~% z( w4 X" F/ ?7 v2 X

. A( x  Q3 I# B4 s) a" w+ C, ]" _

（1） 连接分子# ?' H; Z$ o* g  W
       免疫PCR需要适当的连接分子连接报告分子和抗原抗体复合物。1992年Sano用重组的链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子，创立了免疫PCR技术。该融合蛋白的蛋白A可结合抗体的Fc段，链亲和素可结合DNA分子上的生物素，Sano利用此连接分子把一段生物素化的DNA片断（PUC19质粒DNA）连接到固定在酶标板上的抗原抗体复合物上，成功的检测到了牛血清蛋白，比传统ELISA法的敏感生105倍。& m, i- U$ t1 H  j6 S
       1993年，Ruzicha用生物素化单抗-亲和素-生物素化DNA分子复合体代替链亲和素-蛋白A嵌合体连接的单抗DNA复合体。Zhou等人发现链亲和素（streptavidin）不含糖基，做连接分子特异性优于亲和素（avidin）；Marian进一步指出中性链亲和素（neutravidin）特异性比链亲和素更佳，因为前者是一种经过特殊修饰了的亲和素，大大降低了非特异性吸附的可能。此后链亲和素（亲和素）系统被广泛应用，二者作为免疫PCR的连接分子各有优缺点。链亲和素-蛋白A嵌合体均一稳定，结果重复性好，并且此嵌合蛋白可以利用工程菌大量生产，价格低廉。但目前尚无商品化的产品可以利用，且蛋白A可以结合非特异性吸附的抗体或用于捕获抗原的抗体的Fc段，使之不能用于夹心法。预先把特异性抗体和该连接分子制成复合物可解决上述问题，用抗体的Fab或F（ab′）2段代替捕获抗原的一抗也可克服以上困难。+ J6 M' c, e% c
       生物素、链亲和素系统有商品化的生物素标记的二抗和游离链亲和素可以利用，因而被国内外学者广泛采用。但亲和素为四价化合物，在制备亲和素-生物素化DNA复合体（avidin-biotinylated-DNA complex ABD complex）时会出现3种情况5种分子，即游离亲和素、部分饱和亲和素（结合1～3个生物素分子）、饱和亲和素。只有部分饱和亲和素对检测有用，其他两种情况不但对检测无用而且占用检测位点，降低免疫PCR的敏感性。有的学者采用分别加入生物素化二抗、游离亲和素生物素化DNA分子的方法克服了以上缺点，但延长了检测周期，使检测步骤繁锁，增加了系统误差。有人用2-亚氨基生物素做配基的琼脂糖珠亲和层析法制备ABD复合物，克服了以上不足。
+ v3 `" Y4 B# |  v+ _（2） 报告分子
4 J2 t) \) ~$ ]7 Z$ ?       理论上任何一段序列已知、可有效扩增的DNA片断都可作为免疫PCR的报告分子，但考虑到DNA序列的同源性和用于PCR扩增的效率问题，该报告分子和PCR扩增系统必须保证有良好的扩增效果，有近似理论的扩增率，该报告分子与反应体系中可能存在DNA分子不应有同源性，以避免因DNA污染，而出现特异性扩增。继Sano用PUC19质粒后，国内外学者先后用PINM30、λ噬菌体、舌兰病毒等作为报告分子，取得了良好的效果。郑永晨研究发现线性化的腺病毒六邻体（AdAt）基因重组质粒非常适于做免疫PCR的报告分子。目前免疫PCR的报告分子多数是用DNA聚合酶将生物素化的碱基聚合到DNA末端，理论上一条DNA链上只标记一个生物素分子才具有最高的敏感性。AdAt质粒易于制备和纯化，分子较单一，不易出现非特异扩增，经Hind Ⅲ 酶切后粘性末端上只有加一个生物素分子，保证了免疫PCR的最高敏感性。质粒pHNL10含有编码木薯羟基腈裂解酶的基因，该基因片段是从木薯cDNA文库中经PCR扩增所得，植物DNA与检测系统中可能存在的任何DNA都不同源，用它做免疫PCR的报告分子，可避免因DNA污染而造成的非特异性扩增。
) w5 ^! r  k! B/ T（3）免疫PCR的载体
' {5 V& V6 Y9 a) u9 p       由于适合抗原抗体反应的酶标板不能插入普通PCR仪进行PCR反应，Sano先在酶标板上进行抗原抗体反应和报告分子的连接反应，然后经过热变性，把酶标板上的报告分子转移到普通PCR管中进行PCR反应。此法简单、经济，但步骤繁锁，容易在转移过程中丢失样品，系统误差大，结果不稳定。国外有人用特殊的96孔中V形板做载体，所有步骤均在同一板上进行，最后插入特殊的PCR仪进行扩增。此法克服了上述缺点，但需特殊的PCR仪，价格昂贵，目前尚不能在国内推广普及。用于PCR反应的eppendof管多用聚氯乙烯，在材料上有别于酶标反应板，不适合包被抗原（抗体）。徐平西等人用戊二醛做包被剂将抗原（抗体）高效率地包被于普通PCR管，使免疫PCR能利用普通PCR仪在同一管中连贯进行。
9 s2 K  Y4 Y4 B$ X7 F) a: R* L（4）免疫PCR的显示系统2 l. m6 O- a, p; I6 v
       最基本的显示方法是凝胶电泳法。PCR产物经葡聚糖凝胶电泳后，EB染色，紫外线灯下观察或照像，出现特异性扩增带为阳性。也有人将电泳后的PCR产物印记在硝酸纤维素膜上进行核酸杂交，以杂交信号显示检测结果。另外也可不用电泳，在PCR扩增时用放射性同位素、荧光素、生物素、酶等标记引物，使PCR产物带有一定标记，然后通过放射自显影、荧光显微镜、酶底物显色等显示检测结果。凝胶电泳法既适合单抗原的检测，又适合多抗原的检测，且能区分PCR产物的特异性扩增带和非特异性扩增带，除了EB染液对人体有害需防护外，对环境基本无污染，因而被广泛应用。其他方法一般只适合于单抗原检测，对引物要求较高，且无法区分非特异性扩增带，因此应用较少。) ^4 [/ c2 z6 _$ o" T- c
（5）假阳性的控制8 I7 ]& z0 ]# o9 H0 q
       充分洗涤是必要的，有的学者总共用了50多次洗涤，最大限度地消除了非特异性吸附，但同时也增加了检测步骤，延长了检测周期。充分封闭非特异性结合位点也至关重要，常用的封闭剂有牛血清蛋白（BSA）、脱脂奶粉、鲑鱼精DNA，Chang在PBS中加入2%的BSA取得了良好的效果。适当降低报告分子的浓度，采用不等量引物（适当减少其中一种引物的浓度）均可减少非特异性扩增，提高特异性。另外应设立假阳性指示分子和阴性对照。

免疫PCR优化策略及改进# y) F4 L) D7 M" K0 N* h

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（1）免疫PCR的优化策略——新型连接分子的出现
/ L, W+ m4 B, v( \       1）叶绿素分子和链酶卵白素  * ]! U% J2 i& x3 _  d8 N
       乔生军等用自然界普遍存在的叶绿素分子（chlorophy）作为共价连接蛋白与核酸的中间分子，构建了甲胎蛋白（AFP）抗体的基因探针，此探针人为地把抗体直接锚定在双链DNA分子上，复合分子性质均一稳定，室温至少保存6个月，大大简化了中间步骤，降低了成本，使免疫PCR更易推广。也有人用链酶卵白素将生物素化的抗体与生物素化的DNA分子直接连接，也得了良好的较果。
6 H  c! l; d5 b       2）双特异融合蛋白  
% F5 h( z/ B, }  j$ N       任军将编码单链抗体和链亲和素融合蛋白的基因插入载体在大肠杆菌中进行表达，获得了具备结合生物素和抗原分子的双特异性融合蛋白，可直接连接抗体和生物素化的DNA分子。该融合蛋白可利用工程菌大量制备，性质优良，价格低廉。
3 s3 c# ^: Z. l8 T# Y' L( {       3）生物素化F(ab′)2段代替生物素化单抗  $ o2 n; ?' q% Y) u4 o1 Q0 \5 F
       抗体的Fab或F(ab′)2易于标记，且因缺乏Fc段大大降低了非特异性吸附的可能性，使免疫PCR的本底大为降低。Yashito用胃蛋白酶消化单抗，把得到的Fab段用生物素标记，以此来检测ANP，使其特异性大为提高。, f; `: B/ m+ y* U
（2）免疫-PCR的改进3 t. M. e' u( Q
       虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外，Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modified antigen dilution buffer, MADB）代替Sano免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2M，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI，检测浓度可达到9.6×10-15M，是常规ELISA的105倍。与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR，扩大了检测范围。然而亲和素（链亲和素）作为一个连接分子对生物素的结合具有4价特性，亲和素与生物素化DNA结合可得到5种不同产物，即游离亲和素、结合饱和亲和素和部分饱和亲和素才能在检测过程中发挥作用，游离亲和素与固相中生物素化抗体结合会降低方法的敏感性。
# S! ]* o# p6 p（3）免疫-PCR新技术——多分析物免疫-PCR 5 n! }( V# a! g$ M  d
       在以上的免疫-PCR实验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链亲和素、亲和 素）连接到生物素化的抗体上。这样，DNA标记和抗体就被组装在同一位点上，因此可能产生可变的化学计量。另外它需要额外的步骤加入生物素试剂和连接试剂，并需要众多的洗涤步骤去除过量的试剂和非特异性连接试剂的实验组分，作为一个免疫-PCR实验就相当复杂且需要相当多的操作时间。Hendrickson等人用异双功能化学交联剂预先连接好抗体和ssDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特别是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列，形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并可同时检测多种抗原，避免了免疫实验敏感性的限制和在一个实验中检测抗原的种类。而且，免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫实验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR实验的复杂性，并减少了大量的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改进就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过程如下：6 B' v- ~. z1 H8 a, o4 g1 l& ^
       1） 氨基修饰寡核苷酸与SATA反应，形成乙酰硫代乙酰修饰DNA。
$ P* ]4 V% m; }: H9 p* N( i       2） Sulfo-SMCC与抗体反应，形成马来酰亚胺修饰抗体。3 Q# [* _* O) ^# U+ o
       3） 混合马来酰亚胺修饰抗体和乙酰硫代乙酰修饰DNA，并加入羟胺盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA偶联。
3 p4 `6 G# z8 _+ z5 @       4） 反应混合物用HPLC凝胶过滤纯化偶联物，收集的偶联物在4℃下保存。/ k, g, `% m1 w# \: Y3 g5 S9 i8 v  N$ [
       在这偶联物中，ssDNA是连在抗体的Fc段上，因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上，每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样，一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增，Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明，分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。 : ?) Z7 o6 W: h; S3 S, ]# H
       由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此，在多分析物免疫-PCR实验中，ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA，选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外，在免疫-PCR实验中，dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接，另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中，使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外，长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。

免疫PCR注意事项
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       本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子�