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[分子生物学] DNA重组主要实验

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WANZHAN

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21^# 大中小发表于 07-8-11 18:44 只看该作者

DNA重组实验常见问题分析

DNA重组实验常见问题分析

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TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？; X4 O: ~. _' V; U- u# }
参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。4 L- b- }  [/ ?9 V% D4 h, w4 k

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？  R1 Q7 c. N/ u  W
, I8 }+ g0 E8 \% [
参考见解：
1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下." }+ {, p" T8 g+ r1 a! `$ _" C
2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA片段也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.5 A) Q; F( ]  F- s8 @
3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA片段上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.  S  d% |5 W* g3 @  i0 W/ F

做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。请教该怎么办？* g/ u: x4 k& K5 U8 Y3 F7 c
参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的DNA了。

做PCR将分别将50和300bp片段扩出后，将两个片段连接到一起为550bp，要将550bp片段连到载体上，但550bp片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点AseI一样，想通过部分酶切方法得到550的片段，如果完全酶切就分成原来的两个片段，求教部分酶切的详细方法？
参考见解：可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接，之后再进行平化连接，这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间，可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中（比如50微升体系），37度酶切，然后每隔一段时间取出一部分（比如5微升或10微升），然后一起进行核酸电泳，摸索一下合适的酶切时间。部分酶切的话，时间应该不能太长，可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。/ g: y  K# k* Y' Y, w4 W% k1 U
4 u- ~0 g5 t0 w. g: z+ @
要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基？' A3 ]/ g9 U* X
参考见解：一般37度2小时就行，在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已经足够了。不过若不放心，过夜也没问题。buffer需要共用buffer(比如Y buffer)。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当，酶切应该不成问题。PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab的介绍，hindIII切割的时间较长，如果，直接切pcr产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。如果有条件的话，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer的详细说明，最好依照执行。$ K0 @  e- u4 b1 V% u( L

PCR反应后，是否可以直接用来酶切，而不需要从凝胶上回收后再酶切！酶切后直接在4％琼脂糖凝胶上电泳分型，有四种片段91，83，72，48BP，想用凝胶电泳对其六种表现型分型，不知可行否？( x1 t2 i- t9 e5 Z# N; T2 f2 o
参考见解：理论上是可行的但是主要取决于PCR产物与酶切产物的大小差距，差距太小不容易获得很纯的片断，为什么不在酶切后连在载体质粒上呢，再筛选阳性克隆，是否作表达？至于看六种表型建议用PAGE胶电泳做SSCP，用银染分辨率高，可能能解决问题。  \- Y, _" }# C/ n# ?
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PCR产物经过酶切连接到载体上，所用酶切位点是（BamHI,EcoRI）均有8个保护碱基。但是无论怎么切，总是连接不上？什么原因？% y0 g  I8 F' p& f# x
参考见解：2 d6 l7 r; h9 f  p% Y, w/ t2 Y
1、 PCR产物是否经过纯化了？PCR产物中有较高的离子强度，会影响酶切，如果不经过纯化，则酶切体系中的PCR产物应该适当减少。7 x3 L6 X6 \! I4 R
2、 vector是T-vector还是其他的,如果是其他的话,那要考虑vector在酶切时,是否是切完全了的,将PCR产物测序,看是否有要的酶切site.
3、虽说有这么多的保护碱基，假设它们对酶切足够的，但也要遵循其它的条件，如这两个酶在做双酶切时，是否用了它们能通用的缓冲液？也就是说这两种在这种缓冲液中必须要有足够的酶切效率。有两种方法可以上试：（1）分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到了最大的酶切效率。（2）克隆到T载体中。不知道加的是什么保护碱基，是不是有足够的保护作用？克隆到T载体中，则不要考虑受这个条件的限制。+ w* g. V! v3 u; `
4、按照NEB公司推荐的保护碱基经验，BamH1和EcoRI前加CG就够了，用不着加那么多。当然，加那么多不大会是试验失败的原因。6 j/ H% l+ ?) L( {3 z9 `0 S
5、 BamH1和EcoRI都是甘油浓度敏感型的，就是说酶量加的太多了会引起Star活性。不知你的酶切体系如何设定的。
6、先检查设计引物设计中酶切位点是否正确，然后再重复一次。当然先连到T载体是万无一失，但是克隆周期也延长了。: g1 w% |/ _+ [' H/ i( U
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加了保护碱基，却切不动？$ l1 V) i0 t* r; @, ]5 ]' M
参考见解：
1、酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：
1) 使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:
2) 使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大；
3) 克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。
2、酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。
3、酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。, I- q# r6 K- x/ E& _; E
4、酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！  |/ J; i* c) Y: ~/ p( q5 ^7 g0 H0 K
5、酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

要将目的片段插进载体，选择的酶切位点是Xho1和EcoR1,但是这两个位点共用一个碱基G，即CTCGAGAATTC。还有一对位点是Xba1和Sal1，中间没有空，即TCTAGAGTCGAG。请问这两种情况能不能切开，或是只能通过单酶切来实现？. s; o4 X" S* ?0 ?" j6 L5 C
参考见解：1 P4 Y( d8 d+ _1 x7 p. P
1、还是有可能切开的，双酶切不行就分开切试试。再不行，又实在想用这个载体的话，可以变通一下。设计一个短片段DNA，两头带EcoR I的粘性末端，与EcoR I酶切后的载体连接，获得新的载体，以后再做就不会遇到这个问题了。& U3 T5 a' b  o. m) P2 J0 @) k9 y
2、可以先接上一个片段，再做两次单酶切。例如：载体用BamH I切开，连上两端都是BamH I末端的一个片段------->用EcoR I酶切，回收后再用BamH I切。
3、先用BamH I和EcoR I同时双酶切试试。不行的话，就先用BamH I酶切再用EcoR I酶切。
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怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？
参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双酶切是成功的。当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全，这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。

目的片段连pET32a ，16度过夜，酶连体系为目的片段5μl,载体3μl,T4连接酶1μl，10*Buffer1μl.转化后涂LB－AMP平板，过夜平板长有菌落，但菌落不大，都很孤立，挑取菌落于LB-AMP液体摇菌过夜，试剂盒提取质粒后电泳一片弥散，无目的条带，这是哪个步骤出问题了？
参考见解：
1、觉得是连接体系可能有问题，目的基因并没有跟载体连上，之所以长菌是由于AMP抗性的筛选压力不够，长了杂菌。
2、连接体系可能还需要再考虑，首先是目的片断与载体应该是摩尔数之比为3：1～6：1；其次转化是否也存在问题？即使是空质粒也是有条带的。还有可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较。/ L; V# k$ e. k" P# V' D1 J/ S
电泳了纯化后的目的片段和载体都有，但载体没目的片段亮，酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比？
参考见解：必须计算浓度来估计：
质粒加DNA浓度计算：
质粒 PCR产物0 V3 o! x2 B' N$ b8 E5 I% g! Z
电泳后浓度（OD值）  A(18)  B(14)
相对分子量 C（7300）  D(100)
摩尔浓度 A/C  B/D
体积比  x  y
x.a/c/(y.b/d)=1/3=>x/y=bc/3ad(x+y=12Ul,水为12ul)
x/y=16/1,x+y=123 [( r' |+ ?' _$ y) s9 R
x=16ul,y=1ul! A, z1 N1 Y. u' C7 _5 s" z
hPer11μl  1μl
PGBKT7 16μl  16μl8 i; l9 y, ?- D
T4 ligase????1μl 混匀2 h: e$ L; S1 N
10*t4 ligase  2ul0 l' ^$ v; n& N
水  12ul

载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？& _# h" v: ?) O$ z. w8 G! q
参考见解：
1、用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试
2、 16度过夜连接，或更长
3、单酶切用PCR来鉴定方向方便些
4、去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。# y1 t7 ?( P! i* s
5、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就是跑胶回收。

PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？) ^5 k- a9 T5 l+ m& P, s* b
参考见解:
1、柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。
2、 PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。
3、酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。* ]8 _& U8 V3 p1 y) Y: Y& h
4、大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。
5、大部分是蓝斑，那就是还有白色的。挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。6 Z1 u  |9 g# A) H, I4 b) b# ~$ Y) F
6、建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。
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酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?/ \4 h, V2 }3 s; ]# |* P, Y
参考见解：" B( @% U: F" k* Y/ }
1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。& t% `6 U( j  h1 g
2、酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响./ F, f8 C. G7 n! d% v
3、有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活，一帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：1的范围内连接效果都不错。4 A) }4 X  v4 w* J& @
4、通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。+ c$ H  ^. C3 w4 U3 F$ A
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一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4900bp的片段进行胶回收，效果特别差。用乙醇沉淀法回收，然后跑胶，回收，效果也不好。现在要做连接，可双酶切后质粒的回收不好，用于连接的质粒双酶切后怎么处理？把乙醇沉淀回收的双酶切质粒直接用于连接，这样可以吗？
参考见解：
1、做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。& t% e" V5 a3 l3 H) X2 K% y3 x
2、酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。
3、用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。
4、酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看不到，如果600的带看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600 和 4900的带亮度差别会很大。
5、如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话，可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳，效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题，buffer的问题或质粒的问题。9 J6 @; x+ w. y9 M- U  y8 |

将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明酶切成功，胶回收了大片段。连接转化成功后，挑选的单菌落提质粒，PCR鉴定表明有目的片段，约500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功？若成功了，为何会出现这种奇怪的现象？: r# l: J: z4 \
参考见解：如果pCR没有污染
1、假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果，没连上。
2、假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。
3、最好重新挑科隆，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。
4、应该使用载体引物来作PCR鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。
5、片断是500bp的，而载体切下来的片断中含有800bp，是否是因为重组质粒的浓度太低，使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见500bp的，所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。/ |, w( p9 z% Y; t( x* A
6、可以看到800bp的片断，应该是载体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位，应该没有办法再次切下800bp的片断，所以建议重新挑菌再作。
7、如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断,而双酶切时却只能显示应该切除的片断,说明可能出现的情况是:您的连接成功,但是您挑取的菌落并不是单克隆,而是包含有假阳性(也就是自连接的质粒菌落)的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落,导致在进行摇菌扩增质粒时,同时大量扩增了假阳性质粒,从而出现上面描述的情况.2 D5 @, u3 S- }; v
8、如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量，在酶切片断回收时尽量不要切下杂带，这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。4 i- N% I& J9 p" q. X) n
9、如果不打算从新做过，建议在原来已经铺好细菌的LB固体培养基上，再挑取一些菌落，可以一次性多挑几个单克隆（记住，一定要是单克隆，否则很难处理），中心的和周边的，大的和小的，都挑一些，然后用国产质粒提取试剂盒进行小量提取，并且酶切鉴定，这样可以节省大量的时间，并且取的不错的效果，在用试剂盒提取之前每个菌落保留1~2ml菌液，冻存，并标记好对应的试管，如果之后发现那个菌落是阳性克隆的话，回过头来就可以使用冻存的菌液大量提取了。

载体用CIAP,37度处理30分钟后,用连接酶自连,转化一个克隆没有,同时用处理过的载体与100bp的外源片段连接,转化后也一个克隆都不长.载体和目的片段的摩尔比在1:10。阳性对照长的也很好,该怎么办？
参考见解：
1、片断回收后电泳验证；如果外源片断是切胶回收，一定要在长波下操作2 s8 S7 {8 d4 }8 i
2、载体与目的片段的摩尔比应该是1:1,质量比可以在1:3-10,多做几个梯度,不可能什么都不长的。8 _/ @6 k. x; f6 z
3、插入片断要求酶切好,很多时候是酶切不完全而根本不能连接。比例是载体：目的片段＝1：2到1：3之间。很容易连上。
需要做PCR-based siRNA，其中的质粒模板不够，所以做转化扩增后再抽提质粒。做了3次转化都出不来，总结问题如下：
1.质粒是以前抽提过的，浓度很大，但没有做过电泳，直接加1ul转的
2.感受态制备好的，在冰上直接化开作的。
3.直接用分子克隆上的方法，100ul感受态+1ul 质粒冰上30min,42度热激 90se c, 冰上 2min,加 LB 复苏150rpm 45min,涂Amp板100ul, 16h，但是只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。+ N! |! I  _6 o( i
请问这里有什么问题，有哪些要改进的？
参考见解：& @  W7 F  u) K) k7 S
　　感受态保存时间不要太长，最好3个月以内，保存负70度，时间长效率会降低的。" g" ~" ?% q/ |5 }$ X  k! X
如果合适，可以用蓝白筛选阳性菌落，X-GAL和IPTG是40：7，兰色为阴性，白色阳性+ Y7 G# x# G. v
保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量(根据质粒浓度决定)进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。
　　转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.
　　关于只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。

底物DNA没有被所用限制酶切断，怎么办？9 Z$ J, c  r0 o! @: @
参考见解：
底物DNA没有被所用限制酶切断，可以考虑以下几种情况：
1、底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。* V3 U" G/ e  n: p
2、限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，
3、底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。
4、限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。9 o9 G. D# E$ L: v( N  V8 u6 K
5、测定Sac?II酶是否失活，可用确定带该酶的一个底物，做个酶切验证就行。+ I6 y/ F4 [. D
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请问感受态细胞里自身没有质粒吗？感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ有影响吗？
参考见解：  A' U2 G4 k/ g6 ~% Z
1、感受态细胞自身有没有质粒同制备感受态之前的细胞有关，在制备感受态细胞的过程中，不会对细胞自身的质粒造成什么影响。
2、感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ不会有影响，转座子也会插入到导入的质粒上，可能因为发生的频率比较低，所以不考虑。

实验需用PZero T载体,该载体需用高转化效率的感受态细胞(>=1*10^8cfu/ug DNA)进行转化反应,请问哪种感受态细胞是高转化效率的感受态细胞?+ m3 d! b' w. N, W3 w( j2 _  Q
参考见解：其实ＤＨ１０Ｂ，ＤＨ５ａ，ＴＯＰ１０都可以，关键不是看用什么细胞，而是用什么方法制备感受态细胞，一般电转化都轻松可以达到５*10^９cfu/ug DNA以上．ＣaCL2处理一般都是５*10^6cfu/ug DNA-５*10^7cfu/ug 。

买回来的菌种均为感受态细胞，能否将它们象菌种一样制备感受态细胞，有没有影响？
参考见解：
1、保存这样的菌种，不如将质粒转化进去后，再保留有重组质粒的细菌，加入等量的30%甘油后，可以长期保存。如果直接将感受态细菌接种，肯定丧失了摄取外源基因的能力，但可以用来重新制备感受态细胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱内，可以长期使用，但想当作菌种是不行的。其实制备感受态细胞的方法很简单，除了冰，只要氯化钙,大约一个多小时就可以搞定，所以需要时，可以随时制备，也可以制备一批，加入甘油后在-70度保存。# D, ]4 J8 m) U: n, ^3 `! B
2、利用感受态细胞再来制作感受态，行肯定行，但转化效率不会很高，制备高效率的感受态细胞，其中关键的步骤是一定要细菌生长状态好。而人工制备的感受态细胞经过低温，高浓度离子，相当于细菌受过一次“伤”。因此用来做菌种保存不是太适合。
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“感受态”以及“感受态细胞”的概念？( F" L9 u/ |# k$ c
参考见解：“感受态”是细胞处于易于接纳外源性目的基因进入细胞的一种状态。“感受态细胞”是指处于感受态的细胞。一般情况下，外源性基因很难进入到细胞内只有当细胞处于感受态时，外源性基因才能较容易的进入细胞。制作感受态细胞的方法有很多。
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在加Cacl2 步骤换成了加Cacl2-Mgcl2为什么？这样做效果好么？怎么简便的观察感受态细胞的效果？ # g' p2 U! Q6 b6 Q1 f9 e/ \
参考见解：Mg可以提高感受态效率。其实可以试试TSS一步法：
TSS液：10% PEG，5%DMSO，20-50mmol/lMg 2+的LB，PH：6.5 ；摇菌DD600=0.3-0.4，（其实不必要侧，菌液有絮状浑浊就可以了）离心集菌，悬于少量TSS液中，加入质粒混匀，置于4C冰箱中5-60min，加SOC或LB,培养1小时即可铺板。比CaCl法更简单，效果也还可以。 & l1 v6 y6 a) l% ~4 K
失败的原因只有一个：混进水去了。?混进水指的是收集细菌时残留的LB过多，要把管壁的残液尽量控净或擦净，当然制备好的TSS中混进水去更不行。TSS液越老越好，TSS制备时LB多点少点问题不大，制备完后，静置时间越长，制备感受态效果越好，但制备后再混进水或LB，能使感受效率降低到刚制备的状态。转化时间不宜过长，TSS不光可以做感受态，还可抑制细菌生长。

用于制备感受态细胞的氯化钙可以高压灭菌吗?' A( t( ]- u/ g$ c; y0 \
参考见解：可以高压灭菌，高压时旋松些瓶盖，防止爆裂。当压好后，立即旋紧 4度保存，使用时按无菌原则。但最好不要高压灭菌 cacl2的浓度直接影响着感受态的转化效率cacl2浓度要控制在0.1mol/L 所以可以先过滤Imol/L母液用0.22um滤器过滤除菌 4度保存使用时在超菌台再用双蒸水稀释10倍使用。. `. u2 l- b9 }" T' v( j4 B) S

感受态细胞是否可以转变成为正常的菌种？* G( f7 r. j$ f2 {- j
参考见解：将感受态细胞用无抗生素的LB稀释10000-100000倍后，再涂布到无抗生素的LB琼脂平板上，可以保存或用于进一步制备感受态细胞。或者做转导之前的感受太细胞融化后析出1ul放到不含抗生素的LB肉汤里摇菌，然后再保存菌种。需要时再复苏，按照常规作感受态的方法作。
感受态细胞可以作为菌株来源并再制作感受态细胞吗？
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