高效液相色谱的常见问题分析
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1. 涡流扩散（Eddy diffusion）
$ |- ^3 i: d2 C. d( P 原因和解决方法：流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
$ l' S G2 ]8 l+ D
2. 分子扩散（Molecular diffusion）
3 p7 l2 M; `- ^ 原因和解决方法：分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
. y7 B1 ]3 u, U2 P$ B
3. 质量转移（Mass transfer）
& q! n m' n( P2 u1 r
原因和解决方法：被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。
6 F2 O* p; I7 L: ~; e) _+ b* q
4. 动相流速
* m( B# C, c& E6 b! [7 }* T
原因和解决方法：当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。
% F3 W& v% }# D( k; s
5. 固定相颗粒太小
! L$ x2 ?/ a. r4 V: H7 R+ b
原因和解决方法：固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。
2 a5 R4 t8 h/ y3 `3 O
6. 峰拖尾
0 w1 W3 z3 ^8 U3 W& B; B6 S% V* _ 原因和解决方法：
# E8 G: R, y4 J（1） 筛板阻塞，反冲色谱柱 ，更换进口筛板 ，更换色谱柱 ；
1 w% q) r: {/ U5 F: {
（2） 色谱柱塌陷，填充色谱柱；
G6 U* q$ X" c! Z7 l
（3） 干扰峰，使用更长的色谱柱，改变流动相或更换色谱柱；
4 S" E+ j3 ^9 n8 n3 D8 Q1 u
（4） 流动相PH选择错误 调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰；
& P8 x( l2 n ^. x2 @7 Y. d
（5） 样品与填料表面的溶化点发生反应，加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂，更改色谱柱。
9 D9 X1 \$ @& \+ p/ m7 i, L, [+ F2 a7. 峰分叉
5 ~9 R) ]2 l5 Y) w: v
原因和解决方法：
8 W, `9 u- q ~6 A: v& e
（1） 保护柱或分析柱污染，取下保护柱再进行分析，如果必要更换保护柱，如果分析柱阻塞，拆下来清洗，如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施，如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱，
9 @6 s: O# c1 W% h- e( \（2） 样品溶剂不溶于流动相 ，改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。
5 i# E1 [0 o# Q w5 X; j' Z7 V+ ^8. 早出的峰变形
5 Z- k- I1 V% M* b. J$ T 原因和解决方法：
5 s x3 C5 [1 i! w* X
样品溶剂选择不恰当，减少进样体积，运用低极性样品溶剂。
7 `1 k, K8 o3 B+ p* C1 V9. 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
" n0 Z, l! ]1 Z7 N4 b: n; f9 P 原因和解决方法：
& J5 o9 L. C* m% n+ V
柱外效应，调整系统连接（使用更短、内径更小的管路），使用小体积的流通池。
+ L5 }( y' X; u8 b9 a8 {: D! D10. K’增加时，脱尾更严重
- d8 r+ l' [% n" O5 x6 e 原因和解决方法：
/ I. v# j) r$ u8 F7 r
（1） 二级保留效应，反相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入盐或缓冲剂（或离子化样品），更换一支柱子；
7 Q6 S$ ]0 T7 j2 u/ T9 `, E（2） 二级保留效应，正相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入水（或多官能团化合物），试用另一种方法；
9 e1 |* B- T+ Y# o
（3） 二级保留效应，离子对，加入三乙胺（或碱性样品）。
3 s* `" R) [1 w% P- [9 F11. 酸性或碱性化合物的峰拖尾
% C- m" G3 A4 L, [" t) U+ m! T 原因和解决方法：
" g4 d$ d7 _- F5 a) N 缓冲不合适，使用浓度50-100mM的缓冲液，使用Pka等于流动相PH值的缓冲液。
) C; Y8 E: H4 t5 Q, r
12. 额外的峰
8 O( Z5 \. v! a2 Z 原因和解决方法：
3 J4 S) N* {8 \& g( m4 g（1） 样品中有其他组份，正常；
: A! m" X! {% k5 F) M$ P* h1 t1 n（2） 前一次进样的洗脱峰，增加运行时间或梯度斜率 ，提高流速；
& _! _" O) [- J: x（3） 空位或鬼峰，检查流动相是否纯净，使用流动相作为样品溶剂，减少进样体积。
1 g7 @3 K: I: F7 ~4 \' D' @3 T
13. 保留时间波动
/ X* k( K7 o, M! A6 H& _1 e8 R
原因和解决方法
0 {: t Y W( \0 T
（1） 温控不当，调好柱温；
. E7 x$ ?6 Q$ b/ P4 a% H
（2） 流动相组分变化，防止变化（蒸发、反应等）；
S6 b/ O& c0 l0 ]# ]
（3） 色谱柱没有平衡，在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
) B Z: U, @2 k6 H0 U" [" r4 J; g
14. 保留时间不断变化
# [8 L1 a2 ?8 c
原因和解决方法：
7 H6 t0 S; G$ w; Z; q
（1） 流速变化，重新设定流速 ；
' Q2 n0 T- }" M9 c* K% t1 C$ x4 ]（2） 泵中有气泡 ，从泵中除去气泡 ；
+ _( V) L8 z- Q) n. c9 u
（3） 流动相选择不恰当 ，更换合适的流动相，选择合适的混合流动相。
' ~3 {' L' T7 m15. 基线漂移
/ t: @9 A/ v8 q
原因和解决方法：
8 `1 b( ]& L+ x( \
（1） 柱温波动，（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器）， 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图；
2 a4 k0 u$ ]8 K$ z- t7 } v7 N（2） 流动相不均匀，（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移），使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气；
. X V+ T3 G6 ~( Q& i（3） 流通池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸不要用盐酸）；
- V2 l, P2 [7 I1 L2 ?6 ]- ]（4） 检测器出口阻塞，（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线），取出阻塞物或更换管子，参考检测器手册更换流通池窗；
) N2 ?3 ~5 Y+ m0 C
（5） 流动相配比不当或流速变化，更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速；
& ~, F! G9 F/ m1 _ `2 [! ~
（6） 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时，用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗；
8 q: m" u4 w. E' C6 |2 b
（7） 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成，检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂；
) b$ g" W0 x% w: A（8） 样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线， 使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；
! o7 Y. d9 ]- C2 F* L
（9） 使用循环溶剂，但检测器未调整，重新设定基线，当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相；
: ~8 y# Y8 M0 L% d# L/ b（10） 检测器没有设定在最大吸收波长处，将波长调整至最大吸收波长处。
: ]4 P) o- D$ o. A" C) L8 ]* Q
16. 基线噪音（规则的）
9 y' M7 v$ ]8 t+ A 原因和解决方法：
2 p% Q j' S& f5 ^7 n6 S2 o( \
（1） 在流动相、检测器或泵中有空气，流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；
" ]' |# J* B% W. ]/ X& y2 B（2） 漏液，检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换泵密封；
3 [5 ^% Z H! E6 a7 U（3） 流动相混合不完全，用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂；
; g5 z; J/ |2 Y4 N& J: z（4） 温度影响（柱温过高，检测器未加热），减少差异或加上热交换器；
! |) l8 u- Q; V7 B! J（5） 在同一条线上有其他电子设备 断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正；
; a1 P t' l/ L; }+ @( [! e; {
（6） 泵振动，在系统中加入脉冲阻尼器。
# a+ v4 J& W# a5 g; \17. 基线噪音（不规则的）
U: ]1 S3 F* j% c( C1 D$ ] 原因和解决方法：
: p6 }: j8 i1 w
（1） 漏液，检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换密封，检查流通池是否漏液；
, }/ p, b2 y9 s
（2） 流动相污染、变质或由低质溶剂配成 ，检查流动相的组成；
$ D2 Z; D. F; F Z1 E
（3） 流动相各溶剂不相溶，选择互溶的流动相；
+ r3 F% l7 x. ^3 g- V（4） 检测器/记录仪电子元件的问题，断开检测器和记录仪的电源，检查并更正；
) y E! M; D% Y b5 D* ^: C/ N（5） 系统内有气泡，用强极性溶液清洗系统；
+ E- Z8 ^8 ^" W* X' s$ U7 H# ?（6） 检测器内有气泡 ，清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器；
4 L1 ]) D7 P" C. L（7） 流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音），用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池；
* I' \; ~% F8 a% D; g; i
（8） 检测器灯能量不足，更换灯；
7 ^6 l- ?% c0 O! y+ x
（9） 色谱柱填料流失或阻塞，更换色谱柱；
3 E- e( x" K/ W4 \（10） 流动相混合不均匀或混合器工作不正常，维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。
/ q0 M+ g) U4 V* {
18. 宽峰
" h6 s1 ?( N* Y) [2 J/ g6 f' Y- n) z 原因和解决方法：
8 u/ k F' l4 S2 a$ ?（1） 流动相组成变化，重新制备新的流动相 ；
! H8 S! y9 A1 V" H（2） 流动相流速太低，调节流速；
9 T8 K$ I, T! d9 _
（3） 漏液（特别是在柱子和检测器之间），检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音，如果必要更换密封；
; j# |* ]8 |* U# N2 y（4） 检测器设定不正确， 调整设定；
0 R: Q& ]" x- D2 z（5） 柱外效应影响， 柱子过载，检测器对反应时间或池体积响应过大，柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大，记录仪响应时间太长 ，小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品， 减少响应时间或使用更小的流通池，使用内径为0.007-0.01的短管路，减少响应时间；
S% p2 {( p$ K$ y5 N（6） 缓冲液浓度太低，增加浓度 ；
. {) A% L* Y; v, B8 ]（7） 保护柱污染或失效 ，更换保护柱 ；
! Z; x7 Q, o7 V R, p* ]: _" b- l
（8） 色谱柱污染或失效，塔板数较低，更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；
" k* |. t3 q0 N1 O% J* _（9） 柱入口塌陷，打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；
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（10） 呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰，选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 ；
4 _7 B/ f& A, O6 s0 G8 X（11） 柱温过低，提高柱温，除非特殊情况，温度不宜超过75℃ 12、检测器时间常数太大，使用较小的时间常数；
2 c* J$ d) P n5 C) U& }% B
19. 分离度降低
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原因和解决方法：
% E7 ?; M) x2 r6 d# t
（1） 流动相污染或变质（引起保留时间变化），重新配置流动相 ；
# \: b4 w6 F7 W: N3 U- ^* }（2） 保护柱或分析柱阻塞图 ，去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱，如果分析柱阻塞，可进行反冲，如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序，如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
3 L0 ?2 Q% T9 k" _, \20. 所有的峰面积都太小
* L, @& K# i0 J: e# t* l
原因和解决方法：
& ?0 ^3 v" Z5 G" e% }, L- J) a（1） 检测器衰减设定过高，减少衰减的设定；
) X# q& A! k' Y6 X z, D; \7 L（2） 检测器时间常数设定太大，设定较小的时间常数；
; _( w" X2 s! X) Q6 o" ~
（3） 进样量太少，增大进样量；
* A6 ]% p) m5 l* W7 H, b, v5 `# h
（4） 记录仪连接不当，使用正确的连接。
4 F, u, k8 R% Y4 Z, x% G
21. 所有的峰面积都太大
( [- Q t2 e$ v 原因和解决方法：
( L, K ]9 y: K（1） 检测器衰减设定过低，采取较大的衰减；
9 q2 u1 v [* m( F. |6 s( @7 k; W
（2） 进样过多，减少进样量 ；
0 y/ D# D/ ^& h4 K, b. G- f
（3） 记录仪连接不正确，正确连接记录仪。
