凝胶电泳常见问题分析
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要跑琼脂糖凝胶电泳， 5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？& _. A9 F+ g" g; r; m9 L1 w
参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。
1 L o+ L: L4 k) W/ B$ z
* X( I6 S$ H. @- P1 | V把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢?
0 b2 A( o5 B% f参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照.
" s+ J8 `. e3 B/ M
琼脂糖浓度（W/V） | 大小范围（bp） |
0.6% | 1000-23000 |
0.8% | 800-10000 |
1.0% | 400-8000 |
1.2% | 300-7000 |
1.5% | 200-4000 |
2% | 100-3000 |
丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。
1 P# f# k1 G. o" j
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Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？
- \: K+ D( ~8 b H0 U" {参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。
; K" t" ]: z5 } }6 P
" {: o' Z7 q* \2 ^! f/ I% B/ A7 U琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?, r) u" i. q6 K0 j
参考见解： DNA带模糊??：
1 D" K; e. Q1 n" V0 Z: \4 I- }1、 DNA降解??避免核酸酶污染。
" s [8 S3 n' m$ J2、 DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
/ z' R2 V7 P; F6 ^7 f$ f
3、 所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
+ B% S1 ?5 y n+ [% \! M5 V4、 DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
+ o; x. |; K0 \& h4 y. H- [
5、 有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
4 {* Q( c' i/ r: q! V4 S/ \& o6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
+ E4 s1 n2 P9 I9 ~4 y
; X5 Q Z$ d8 F将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？. }7 ?2 O0 \- o3 z+ u( n
参考见解：
% r! w. K, G3 g
1、 根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。
! t+ D' \; N6 \- W3 D- M, m& C2、 紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
# d, \; W( S0 ~0 k; s2 J( B( }# ?
3、 最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
# j9 H' l0 r* X
4、 电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。
) o* d3 k! z8 u; k, H, `7 y+ V) x; c* T
8 ^! i. X, @" k9 [, T4 u6 G0 ?
内切酶酶切后应该产生300+74+25bp的3个片段，用琼脂糖凝胶电泳能不能跑得开？如果能，得用多少浓度？" f2 G) |: r, h3 h1 a. k' `; v
参考见解：
+ l" A. v6 p5 @6 G% T
1、 分是分的开的，只是不知道要不要看到这条带，如果只是对多个样本的分析的，那是完全没有问题的。用2.5~3.0%的胶跑过，不同样本间是肯定看的到的。当然，25BP这条带是看不到的。
, w5 O1 X& s- F0 r* v7 r3 B. l2、 用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行电泳分离，可以分开的。不过缓冲液要用0.5的TBE，不要用TAE，其效果差些。下面是10ml的配方：
- G. V# W7 ^) A/ E) z! w; U
9 G& X5 y( l. U30％丙烯酰胺母液 3.3 ml; X" \1 i0 f9 \! E: ~# A' K
5 × TBE 1ml. M5 i* X1 i& P. T2 K" [) k: \5 B
10% A.P 70 ul' Q7 c" l0 @2 k6 g, z
TEMED 5ul
9 v. G+ A9 R$ ?0 n120v 1.5h
( ^/ R% X) Z! W
7 L X! Z1 I/ g在pH7.6的TBE缓冲液中进行质粒（DNA）的琼脂糖凝胶电泳时质粒向哪一极运动，为什么？如在DNA样品中加足够的亚精氨后再电泳会发生什么现象，为什么？
' y w# m% D# k. k: O2 i, o; e参考见解：
, x ]) L1 A: T% w" p$ [: X1、 DNA分子在碱性凝胶缓冲液中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。
8 Y( ~ T8 a7 g. j2、 样品中加足够的亚精氨后,亚精胺头部的强阳极性使整个分子高度亲和于DNA，DNA与碱性亚精胺结合,结合分子带阳离子。
8 v2 j9 r8 q% o6 h; I5 J& ~# ~ P, N! z! M1 M
在琼脂糖电泳时0.5CM孔DNA上样量不宜超过500ng;可是当组分不同时可加20~30ug这是怎么回事?
, V! [# u5 K' G; U& [9 w6 O) a参考见解：单个条带不超过500ng，如果有很多条带的话，总量500ng可能就会少了点，条带不清晰。
& |% v' Z c7 C- k: B, M
; o7 \/ S- I- V. N9 r! k怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？
% D' x+ H( H2 M参考见解：
! }2 a% y2 [+ ]0 a& p) }: j) d* E8 f
1、 跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
, R' b; Y1 a; e# M
2、 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。
( k. _, C1 I" h4 J+ D: N% p7 e
3 p( a% u5 m+ ^, ^变性单链DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率与什么有关？应该选用什么marker？marker上样时要变性吗？7 T# {+ A* {" s/ d9 f3 f+ G
参考见解：电泳迁移率(mobility)：如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即：
5 _( l6 F% [& f: Q3 w$ j
F = QE (1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律：
" K! X. K* L. g* I' I7 e; L' P7 i( v7 b5 ^0 V
F’ = 6π r η v (2)这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。
5 |, e. \; n r当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出：
' P# _- _- J& k$ J4 P9 ~
v Q
- w3 P: k1 a! Y) E- t——— = ———— （3）
: E! h: f" ?9 F$ X. HE 6πr η
: I+ j8 c6 Y* O, l2 i不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度：
8 z( d6 q4 G9 N* ~/ B- _
v d
9 L( ]4 D+ S2 X* Em = —— = ——— (4)
' b6 c3 x$ n( cE t·E
0 {4 z! F5 t( Q* g9 h* A2 b6 o
将(3)代入(4)，得到
4 @6 a) w, w3 m& u, O4 wQ
# R* k; ?; n1 c0 s+ I8 L% A
m = ———— (5)
* W, \7 H6 u v3 b6πr
7 m* X$ i4 u& L5 \) z/ `
由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。
3 J% j& o# N _" k. g
+ b5 n, G$ {2 ~" I0 w& d请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？) N- B, y, Q6 ~, ?/ X
参考见解：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
6 b# h2 U6 J: C- {一个让PAGE胶很快聚合的方法：
2 b7 P" F* b& P. x) [( O7 p
不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。
^/ Z! ~6 m0 q; v% u: ^7 U
( Q8 O: Q. F4 z& }- t5 I5 ?DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？
8 D8 f* [% K: {9 ?8 [, V. P参考见解：
. n3 q( G: {7 Q$ d* Z8 n1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。
% o# [1 r3 W" g9 s7 ^8 ?6 A' |: G
2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。
& ]2 |) |8 ~* g5 K4 A, ]8 l3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。
- Y% |# I2 N* H/ t
( w u1 V5 C! ~# E" w0 {7 E8 x
跑出的DNA带模糊？/ {/ ^6 N$ D3 O/ a
参考见解：
7 L! T. j% U9 R+ m
1、 DNA降解：避免核酸酶污染。
6 C3 @) {6 w7 U# X$ X
2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
( O% c% }: K- m; [
3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
. g: K5 e {# s! t* ]2 M4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
# V; n" O4 U9 F/ \5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
$ t# z' j5 g8 U9 i- {
6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
) Z& b+ d* ?$ }8 i+ q, l. r( l7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
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有不规则DNA带迁移?, P) ^$ q: l `7 A3 B) [ q
参考见解：
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1、 对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
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2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。
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3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
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. l+ p: ~, o& ~- [/ R跑出的DNA条带带弱或无DNA带？; U+ P% i8 \6 }# `9 }: {0 S1 N
参考见解：
+ N$ @7 J6 t% Y- o$ ~/ a& W! Q+ G1 N8 ~1、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
3 T- M% A+ b0 K* }9 b2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
) Z y& z8 g/ R3 o$ |3 y- N3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
* g- ~0 T2 J, Z Q% V8 t! m4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。
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1 E& \* a `5 ?. m+ \
跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?
) @' y+ [5 N' E% ~参考见解：?
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1、 小DNA带走出凝胶??缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
" q* Z9 _- R" Q" O2、 分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
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3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。
" M/ o' U; i( `) T+ ^, J5 ^, t% sDNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。
! K. _9 `! u& B1 G" [5 z! ~0 x& m5 ^$ S
' }7 a( ?! u5 h/ j: ^! l& g做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？
& ~4 `( A" B! t7 M7 ]6 h' ]参考见解：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
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0 [8 `1 i+ |. {- K" o& Z跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？4 L! ^. u( f6 M x) \
参考见解：还有个问题，pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？
& p) C; L! l2 ], w/ K" P
割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。
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X6 [' k* W8 x7 U: i$ s0 s3 [凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
3 r" c7 r# D* _8 R6 F参考见解：最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。
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切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？
. o5 m- X" u& z& ?; M5 V$ {2 |8 }参考见解：可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。
