聚丙烯酰胺凝胶电泳
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实验试剂：+ D$ b. s; `" l! X1 W9 }
试剂贮备液：
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1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。
. J9 c! B) K- G* p& u3 b1 H2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。
" K, S) m: Y9 H3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。
4 a" r* J+ j! A& ^4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。
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5、 核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。
6 J* x3 T6 J3 g3 Q; f6、 蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。
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7、 电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。
8 g! r* m, P4 F2 G- t8、 过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。
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9、 溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。
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10、 脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。
; n- K, k3 Z7 Z' O$ C11、 蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水
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80ml，溶解后混合之。
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12、 过氧化物酶染色液：
6 a6 Z; r4 K( F% w. W9 G1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。
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2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
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) z. |( M! a1 N$ Y9 ~" Z实验步骤：
5 t5 p; D. t" D+ y b$ y6 A% s5 g凝胶的制备：* o; C* s6 k' M8 u& q
1、 清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
+ J! p1 J2 w9 S. Q) _9 ?2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
2 ?* k `( D# V0 \! ]3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。
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4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。
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电泳步骤：
* \9 _* q. I: {, k1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。
* Y$ \7 Q5 ^8 O, D2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。
* n! V' c) ?3 D' e4 v" @5 H: J: l# j6 n3、 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
+ o( U" u7 y4 A5 s$ h) f4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
' |7 T6 B$ `/ T: _! i; f5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到区带清晰。
?) N8 V8 d/ h( z0 n% P6、 实验结果分析。
/ q3 w4 i+ O" T+ n( Q& a4 f注意事项：
9 b6 ?- _: D4 R0 h& q2 ?! O1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
' {( z4 x" O% L- e% |4 Z2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
1 A* M2 h- ]# E& I/ l3 f! t3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
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4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
: A; p( {! X9 K4 J+ e5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
( ~2 t2 k) z% T6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
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7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。
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8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
7 |. L" Z, A* T& w9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
