RT-PCR

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主要内容：$ G$ x7 h( A/ c% J7 }

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• RT-PCR原理
• RT-PCR实验过程
• cDNA文库构建
• RNA酶保护试验
• RT-PCR反应体系酶的选择
• RT-PCR一步法同两步法的比较
• RT-PCR反应体系的优化
• RT－PCR常见问题分析
• RT-PCR应用

6 A; p7 M( `) r7 d7 U声明：5 A: J6 T  o0 `; s5 g/ [- l" \
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整理者：WANZHAN   审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88
5 h. I* Y9 z  d# [1 V主要参考资料：《分子克隆实验指南》; Y0 Y+ G' j9 r- ]) l% t3 L! N
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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:12 编辑 ]

RT-PCR原理

9 Q- G) y/ _" D/ G4 n5 }　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。: n5 I0 {9 g4 y# p+ E/ J
　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
8 u$ D* A' b  p9 a, k- |2 R& N逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：* k- Q! r& |$ O  i* e4 u* ~5 [
1、 依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；9 h! _& ]: c( H
2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；
+ E8 N3 t4 I/ p$ x% C* t+ O6 ]+ u! S6 t3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
1 K- a+ C$ c3 @用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。3 y- k" c+ w- Q, _; g' ~# K. B/ _

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& t) {5 P1 P8 }, Q[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:10 编辑 ]

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" t: p4 B/ p# O- D: y  J) i6 z( M. l  c; u[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:14 编辑 ]

RT-PCR反应体系酶的选择

. n3 N" Q: h) B8 o反转录酶的选择：2 y3 x. {3 s/ _/ y6 B$ ~( N
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。5 _7 m8 D' J* [/ i4 U. l! w
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。- ?) }, l( C2 n# ~6 T3 S/ q! s2 ^
3． Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
. p8 K4 M0 y9 Q' Y2 @3 P4． MMLV反转录酶的RNase H-突变体：Invitrogen公司商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
: K, D. `% y' w4 D扩增酶的选择:
; \2 d: _5 _, l( [7 e8 k1． 对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶。
. T3 l( _6 {6 v* r, @2． 对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。5 v  ^% \* b. W: b" ]
3． 对于大于12kb的产物使用ELONGAE? Enzyme Mix。
* [/ @+ S4 h5 n0 @4． 对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。0 Q- ^/ K1 j& A4 I5 }3 t
3 k) F1 K! ]( g0 L3 [
[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:20 编辑 ]

RT-PCR一步法同两步法的比较

  J* e! d4 h  D* z, t1 e　　两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。
, d# T9 q4 G5 e/ P

一步法	两步法
起始第一链cDNA合成使用：	起始第一链合成使用
Oligo(dT)	GSP引物
随机六聚体
GSP引物
优点	优点
•灵活	•方便
+ e0 Q* `% O. f1 d3 J引物选择	9 s9 {$ J$ J- [5 v- `扩增酶同逆转录酶预先混合
, ^8 Q  u* ~, I" e7 z 扩增酶的选择	+ U! |. \4 G0 t: J3 ~5 j转管步骤少，减少污染可能性
•困难RT-PCR的优化能力	•高灵敏度
* A" I" W- a: |7 I, Z' R' Y同Platinum®酶结合提高特异性	•适用于大量样品分析
r* h: f, e7 x, y8 l 同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性	•适用于定量PCR
•适用于在单个样品中检测几个mRNA

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4 M; Y) o, ~8 e/ d2 Y. |8 c9 F[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:16 编辑 ]

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