免疫组化常见问题的处理
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1. β1整合素抗体在大鼠皮肤上做免疫组化时，本应定位于细胞膜，但实验中不知为何在细胞核显现阳性。请帮助分析原因
* h* i6 I. F$ s- O6 a参考见解：有些理论上定位于某处的分子，在实际组织中会有出入，一则该分子有摆动表达的情况发生，二则与你使用的是何抗体有关（单抗、多抗），三则与你所做的切片抗原修复有关。第一种可能性最大，你可以增加阳性对照（如纯细胞株爬片免疫组化）再试。
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1 @6 i" q9 S* |: r) {+ ?) C4 H' ]2. 对照/标本无染色 i. S) _6 \, B3 ]* t9 B& Q" w
① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
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② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
# J3 k* |) ?! p \! ] x0 ^③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
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④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
# A* _% q- U5 _+ e1 m& k⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
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⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
% d1 S0 H# N: C i( G, e⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
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⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
- |1 e+ A5 _: {$ A8 ~⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
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3. 弱阳性
/ _% R' E7 t, b如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
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① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
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② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
# [: q( f3 l5 k' ?) D! c, W③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
p* q. Y) C3 Z2 _; J④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
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⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
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如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
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4. 非特异性染色0 {: V s% _1 w/ j6 e
① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
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处理的方法为：
& Z' x% B7 n# G* r5 j) i灭活碱性磷酸酶：
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最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
( c2 H' k$ P- M, p, ~, f饱和处理内源性生物素：
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消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
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② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
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③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
" z$ J F( e: b- f- F8 S7 O; }④ 一抗的使用浓度是否过高。
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⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
t T+ m+ {0 q2 P/ D0 p" j⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
6 a% h! u6 R0 E Q$ v! x0 U⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
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⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
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8 v+ f4 }7 |8 S n; ~1 O5. 交叉反应
) a2 o2 h* f/ D6 Q! b3 }1 R5 y指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
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1）抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
P% `+ u9 S. X2）共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
7 G5 T( L4 W0 t; Q' R3）决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
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6. 多抗和单抗特性比较 - F3 }4 X6 d% t- F7 p" J- C
1）均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
" x7 g/ a) {" i% k2 `9 v4 S2）稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
/ X% B5 ^2 y3 _3）特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
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4）重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
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) S/ k/ |' [# [7. 如何应用免疫组化进行病理科研设计？0 f0 ?# B; f7 z8 p/ f
科研课题的基本要求至少有四个，即创新性、科学性、可行性和推广应用性。关于创新性的重要性很好理解，谁喜欢东施效颦、拾人牙慧、人云亦云的文章？谁不想标新立异，“国内外尚无类似报道”？可对于病理科医生尤其是基层病理科医生，采用免疫组化技术进行创新性的科研，似乎免为其难。其实如果调整一下思维角度，难者也就不难了。我们在这里甘冒才疏学浅之嫌，介绍几种简单可行的创新性方法，以请教于病理界同仁。
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方法之一，采用新抗体，这是最简单的办法。如金属蛋白酶MMP-9抗体是一种新抗体，其抗原MMP-9与肿瘤侵袭和转移有密切关系，但采用此抗体和免疫组化研究肿瘤侵袭、转移的文章国外少见，国内尚无，读者不妨一试。
% c: w" ~8 h9 H, H" ^7 b% j, d 方法之二，旧抗体新用途。比如关于凋亡及其相关因子表达与肿瘤发生发展的关系的研究，国内外有大量报道，而关于其非肿瘤疾病的关系的研究，却报道很少，有的甚至迄今未见报道。如果你将P53、bcl-2、c-myc、Bax、ICE等凋亡相关基因蛋白抗体用于非肿瘤性疾病研究，一定会获得新发现。再比如，P-糖蛋白抗体绝大多数用于肿瘤耐药性研究，却极少用于非肿瘤性疾病的研究。正常肝、肠道、肾等均表达P-糖蛋白，在非肿瘤性疾病时这种表达有什么改变，这种改变又有什么意义，迄今尚未了解，读者也不妨在这方面施展你的身手。
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方法之三，同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究二种或二种以上抗原的协同表达，只要这几种抗体选用合理，也比较容易获得新发现。
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6 Y8 H7 w5 R3 F, W+ C 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。
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. i7 m) ^! X5 u8. 无色片
1 h" x$ }. D8 l8 P 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：
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1）真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
! O7 H2 z$ F; Q; ` 2）假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。
) g8 T' N* Z2 ]4 `7 U7 y 假阴性结果又可分为两种情况：
& ~# ?- {# v5 H7 g* j （1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。
3 V& g+ C4 u0 P2 J" L2 y （2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，
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虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
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解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
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设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。
, J' w& j$ |$ O# U } 抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。
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9. “杂音”染色片
" F( N6 H: ]% C1 c( h 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。
& I+ T W! R! S* a: s （1） 全片着色4 \- l2 ?# f) a
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
4 n. Q0 o$ h+ V) B. b. G0 @6 }$ T 1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
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2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
8 J0 B9 E4 ^8 B8 w1 p' X$ _) a$ \ 3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
' \* Y6 O5 n% E" B5 | 4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
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5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
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6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
/ P) w: l5 G3 _' F （2） 切片边缘着色
u4 [- D( u0 T# J7 M 切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：
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1）、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
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2）、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4 mm。
/ h: R- u8 T- F" ? v （3） “阴阳脸”着色
% r; z8 {0 c( C$ L' Y/ g 指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。
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（4） 灶片状着色5 [8 D) F. f3 g+ d+ {7 d) Q' U
切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布，出现这种问题的原因有：
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1）、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。解决办法是，漂片盒里的气泡应去尽，晾片热台不能平放，应有45度左右的斜度，利于水流走和蒸发。
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2）、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。
6 h1 g! I k9 h/ e5 k2 x0 E) W: G3 f3）、制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行，即5%盐酸酒精（5ml盐酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥（室温）、2%APES（2 ml APES+98 ml丙酮）浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮（1-2秒钟）、玻片过一下蒸馏水（1-2秒钟）、37°C过夜干燥、室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。
9 w3 j3 y5 K0 e2 W （5） 间质着色
' N& r4 H3 `9 K0 s+ m 着色部位主要在间质，间质着色的原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色，加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色，我们曾遇到CD20抗体不纯，除了染上B细胞外还染上了间质。
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（6） 细胞浆着色
( @4 L) |; K0 j& {7 g3 d2 r 胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织，内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA，热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干扰。
9 V1 D: y& x- Z2 \) g （7） 细胞核着色
4 m8 g. @3 s" }/ @7 F" _) F& s 不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯里浸泡时间太长（如从星期五浸泡到下星期一）、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。
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0 o; e7 t) @+ u10. 染色常见问题
: y; v$ s6 y# W( N9 S1 z( h1、染色过强
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: Z/ n( Y6 T {& d G! H; O7 C原因 1 J. m7 `" s. j( a. K( H
| 解决办法# @: J$ S& Q3 z/ X
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抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长" f' I4 N3 e. E% y
| 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
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孵育温度过高，孵育温度超过37℃, G% u6 v ], `" k2 h5 M
| 一般室温20-28℃
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DAB显色时间过长或DAB浓度过高5 R' A6 |- g% T4 P
| 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准4 V/ f5 U1 T' o$ Z! Y
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: L8 ?% T" D3 v* D# d, t0 x
2、非特异性背景染色 6 G& a1 J( V8 ]6 Z; m6 U0 z
原因
' B$ I* Y5 P0 o) Z3 ^" |* s | 解决办法0 Y) v6 e" A4 T+ F" ?
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操作过程中冲洗不充分6 C/ x: y4 f; v8 _
| 每步冲洗3×5 ! q$ @& W" x# _) B+ Q% P
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组织中含过氧化物酶未阻断8 P# a. t6 j, F4 K
| 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 ' _4 F5 X2 U7 i0 E4 ?. ^
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组织中含内源性生物素
/ J0 ]( j% T2 [ | 正常非免疫动物血清再封闭
3 s$ D$ t% \! N' z# w" I |
血清蛋白封闭不充分
. b+ ^& H( s: t | 延长血清蛋白封闭时间 % d! Z) g* n* s Q+ ?- {
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+ ?8 b' S* s# o; d3、染色弱
# l% b5 ? z$ k; {2 |原因
% W, W! I; c% m/ J | 解决办法/ S0 \% K, [ o7 C Z8 _0 j2 s
|
抗体浓度过低，孵育时间过短
, {7 q9 E5 y: v- Z6 j; b | 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟# R ?6 S D0 f( a
|
试剂超过有效使用期" o0 q$ t" p" H9 ]
| 及时更换试剂7 e3 C L1 G) `' c4 F
|
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释
: w4 B. g* e, |6 i# `) m) g) d | 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）/ K+ K) v( A% i" v2 T
|
室温太低，低于15℃
& W# T; B, C7 T( c | 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）& a3 H/ `# t+ w& n
|
蛋白封闭过度
) t8 T; d: d+ m9 p% M M | 封闭时间不要超过10分钟* z+ j, P8 H9 t8 W: U3 B
|
5 M {8 ]9 Z$ X
4、染色阴性; S, a$ i8 {( F' m0 h/ k
原因! c! z$ N( D6 B, F
| 解决办法
/ ]% v5 B$ [( U }1 G+ P" Y |
操作步骤错误& u4 u$ I, \! A
| 重新试验，设立阳性对照 . g* o% D% ?8 _, B( u
|
组织中无抗原 , d' K E7 X: {3 S
| 设立阳性对照片，以验证实验结果
w" U7 G) _5 |( U/ f3 v/ @/ w |
一抗与二抗种属连接错误
) m" q1 f, X; h/ R* f( ^1 l | 仔细确定一抗与二抗种属无误 0 T/ B: W( T# W1 k
|
2 d: p( m1 J8 D5 E) O2 j/ m+ |# J
( \9 W; a7 M6 B1 s! M: ?) }3 q+ E0 m# z
[
本帖最后由 microfox 于 07-8-9 19:51 编辑 ]
