免疫组化技术之免疫酶法
& w3 J$ V; b3 x: ]+ \ 免疫酶法是借助酶细胞化学等手段显示组织抗原（或抗体）的新技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。免疫酶法的基本原理与免疫荧光法有所相似，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。已如前述，免疫荧光法具有操作简便、灵敏、特异性高、省时的优势，但同时也具有令人遗憾的不足，特别是荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。为此，Nakane等人（1966）尝试了用酶代替荧光素来标记抗体的方法，从而成功地开创了酶标记抗体的新技术（酶标抗体法）。Sternbenger等人又将非标记抗体过氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的进步，成为当今使用最为广泛的免疫组织化学技术。
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免疫酶法与免疫荧光法相比较，具有以下优点：酶反应产物呈现的颜色不仅能在一般的普通生物显微镜下观察，而且其产物因具有一定的电子密度也可在电镜下观察（免疫电镜技术），光镜与电镜的结合，使灵敏度进一步提高，标本又能长期保存，并能加设HE染色等其他复染，有利于将被检测物质与病变的形态学改变联系起来（定性与定位），弥补了免疫荧光法的不足。
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从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体进行免疫酶法染色，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。sternbenger等人指出：用于标记的酶应具备以下六点：
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1） 酶催化的底物必需是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于 在光镜和电镜下观察。
5 y, q/ ^# y# M8 T5 N 2） 酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。
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3） 较易获得纯的酶分子。
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4） 中性PH值时，酶分子应稳定。
6 A/ L' p) t/ Y 5） 在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响二者的活性。
! H+ d8 ]0 Z0 [4 B2 ? 6） 被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。
/ y/ h2 k7 a$ |1 P& Y6 H1 G 上述六点中以1．2两点最为重要，因为并非所有的容易显示的酶均能形成不溶性的复合物。符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，H：：flJ）。其次是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP），除此两种外，还有葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。 HRP广泛分布于植物界，因其辣根含量最高而得名。它是由无色酶蛋白和深棕色的铁叶结合组成的一种糖蛋白（糖占18％左右），分子量为40000道尔顿，等电点3~9，最适 PH为 5.0左右。HRP易溶于水和58％以下的饱和硫酸铰溶液，其活性部分为铁叶琳，称辅基。酶的蛋白部分无活性。酶蛋白和铁叶琳辅基的最大吸收光谱分别为275urn和403urn；HRP的纯度用两者的光密度比值（M03人工卫75）来衡量，以RZ（Reinheitzahi）来表示。一般认为，标记酶的RZ值为 3.0左右，不应＜2.8，RZ值越小，酶的纯度越差，对于纯度低，质量差的酶，需经纯化后才能使用。
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AKP是一种磷酸酶的水解酶，磷酸单酯酶对于连接于作用物磷酸基上的醇基没有特异性，因它可以水解多种有机磷酸酯，生成醇和磷酸盐离子。该酶在许多人体组织或动物组织中有分布，如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等。AKP的分子量为80KD，最适PH为9.8，其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响，如用二乙醇胺缓冲液（1mol／L，PH9.8）对AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用甘氨酸一NaOH缓冲液则对AKP有抑制作用。AKP的活化剂有镁和锰离子，Mg++的适应浓度为10mol/L。甘氨酸、柠檬酸盐，EDTA等对 AKP有抑制作用。AKP对温度具有较高的敏感性，从 25℃增加到 35℃，其催化反应速度增加 1.5倍。当选用不同的底物时，AKP可催化形成不同颜色的终产物。例如，萘酚一AS一MX和快蓝（Fast blue，Fh）为底物时生成蓝色产物，可与HRP催化的产物形成鲜明的对比，用快红（Fast red）代替快蓝则生成红色不溶性产物，而且内源性AKP较易清除，可以较好地避免内源性酶的干扰，使其具备了某些独特的优点而日益备受重视。
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GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基蓝四隆（Paranitroblue Tetrazolium），终产物比较稳定，为不溶性的蓝色沉淀。从理论上讲，GOD较AKP和HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性葡萄糖氧化酶，这样可以很好地避免内源性酶的干扰。但是，GOD的分子较HRP大三倍，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，而影响酶的活性。
( w/ T. b/ ~7 v) E1 U7 p5 w 免疫酶法与免疫荧光法大致相同，也可以分为以下几种。
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（1）直接法& u: o( Y9 G8 h+ C
用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。
7 N" }) S! Z K, ?% q K. K+ C/ x2 i& Z 直接法的第一步是特异的——即酶催化底物的反应，其余步骤则是非特异的，可用各种电子供体介导。以HRP为例，HRP的底物是巴H2O2，在分解已过程中，与H2O2形成初级复合物，无电子供体存在时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物，继之HRP催化H2O2所形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供氢体被氧化，聚合，再经氧化环化，最后形成引哚胺多聚体，于酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰，达到定位、定性、定量的目的。
! }9 s* `- l$ _; F 直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。其缺点是，每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且敏感性较间接法低。
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（2）间接法
, e8 a% G" x) y [ f0 Z5 [ 间接法是先用未标记的特异性抗体(一抗）与标本中相应抗原反应，再用抗特异性抗的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗（即特异性抗体）反应。例如，第一次使用的特异性抗体(一抗）是由家兔产生的，则第二次使用的抗体（二抗）必须是酶标记的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的酶标记物（即酶标羊抗兔IgG）。然后与直接法相同，与底物反应、显色、将抗原的性质，部位和含量检测出来。
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间接法的优点是用一种酶标抗体就可与多种特异性一抗配合而检查多种抗原，而且敏感性也优于直接法。
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（3）酶桥法
; Q3 q) r1 l8 c+ I% [5 U$ V' M 酶桥法的建立是免疫酶法重大改进的标志。将用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改进为用酶和酶抗体免疫反应而结合的方法，避免了由于化学反应过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。其基本原理是用酶免疫动物，制备高效价、特异性强的抗酶抗体，然后用第二抗体作桥，将抗酶抗体和特异性的第一抗体（即连结在组织抗原上的抗体）连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经过酶催化底物的显色反应后，显示出抗原所在的部位及含量。作为桥的第二抗体（即桥抗）必须对特异性抗体（一抗）和酶抗体都具有特异 性，这样才能将二者相连起来，因此，一抗和酶抗体应由同一种属动物产生。例如，特异性抗体和酶抗体都是兔产生的，再用羊抗兔IgG作为桥抗体就能将两者连接起来。在此 过程中，由于任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合的，避免了共价连接对酶活性的影响，提高了方法的敏感性，同时也节省了特异性抗体（即一抗）的用量。
: j, s" S# H; @: i+ g% p 酶桥法虽然克服酶标记抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶的活性，但是仍存在不足，其主要表现为①在抗酶抗体的抗血清中，含有低亲和力和高亲和力两类抗体，它们作为抗原与抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲和力，而与其本身对酶的亲和力无关，故两者均可被连接在桥抗体上，由于低亲和力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使部分酶丢失，从而降低了方法的敏感性。②抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但却不能与酶结合，这样影响了组织抗原的显示。为解决这些不足，70年代初，Sternberg在各种标记抗体法和酶桥法的基础上，建立了PAP法，并加以改良，成为应用最为广泛的免疫组织化学技术之一。
6 O% I& }2 d, X （4）PAP法% Q- o5 h0 Y: _: ?. R
PAP法是酶桥法等基础之上建立的，其基本原理与酶桥法相似，都是利用桥抗体将 酶连接在第一抗体结合的部位，所不同的是，将酶和抗酶抗体制成复合物（PAP）以代替酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，将两个步骤合并为一个步骤，这一重要的改进，不仅仅是简化步骤，而具有更大的优势，因为PAP是由3个过氧化物酶分子和2个抗酶抗体分子结合形成的一个环形分子，排列呈五角形结构，3个角辣根过氧化酶（HRP），另2个角为抗HRP抗体，其分子量为400，000~430，000道尔顿，直径约为20.5nm，这种结构异常稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了敏感性，Petrali等报告，PAP法比酶桥法灵敏度高20倍。有人认为是免疫荧光法的100~1000倍。
4 k1 @ s* I5 y3 w* r+ K. z- F# A PAP法应用广泛，其主要优点为：
4 |: L4 F( C7 `8 b3 P1 f 1) 最大限度地保存了抗体活性。
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因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶标记，避免了标记过程中对抗体活性的损害。
4 @( L% ~" v: |! i8 P! y3 I" i 2) 灵敏度高。
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由于是多层抗原抗体反应，由于免疫放大作用，使得结合在抗原抗体复合物上的酶分子增多，并且PAP法复合物性质结构稳定，这样与酶底物反应后的呈色反应增强，使微量的或抗原性弱的抗原显示出来，提高了灵敏度。
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3) 背景淡。
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酶桥法中，酶标记的非特异性抗体可与组织抗原结合，引起背景染色，给结果判断带来了很大的困难。
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PAP法中，连接抗体中即使存在着非特异性抗体，因其不是抗IgG的特异性抗体，故不能与抗HRP抗体相结合，也就不能把PAP复合物连接在非特异性抗体上。当然PAP复合物内也可存在一些非HRP特异性抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分相结合，但因其不是抗HRP抗体，所以不能与HRP结合，也就无酶活性及背景染色。背景越淡，当然越有利于结果的判断。
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PAP法的不足之处是PAP的制备较为复杂。
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双PAP法又称双桥法（double bridged technique），是PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，可提高敏感性达20~50倍。一般认为，双PAP法通过下述途径来提高敏感性，①重复的桥抗体与PAP中的抗HRP抗体的抗原未饱和位置结合，再连接PAP复合物，即在抗原之处，抗体间形成更大的抗原抗体复合物，具有多个酶分子，使免疫染色增强。②重复的桥抗体，与特异性的第一抗体未饱和抗原相结合，使第一抗体上结合较多的桥抗体和PAP复合物，起到放大作用。双PAP法的不足之处是步骤多，需时长，在实际操作中，可能会带来非特异性放大的问题而影响结果的判断。
& ^ A |6 X( n: [3 b' P3 M( D （5）APAAP法- ?' K; S* {4 k6 G- |
APAAP——碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP）法是Mason和Moir（1983）等在PAP法的基础上，用AKP替代HRP而建立的一种方法，都属于未标记抗体桥联法。APAAP法与PAP一样，利用桥抗体将AKP连接在第一抗体的结合部位，而AKP和抗AKP抗体被制成复合物（APAAP），通过APAAP复合物中的AKP催化底物显色以显示抗原物质。
0 A3 x, t8 a! s1 N ` APAAP法的主要优点：
* f) `; n0 u) `7 a 1) 在内源性的过氧化物酶较高的组织中进行免疫组织化学染色时，APAAP法较 PAP法具有更多的优势，仅需稍加处理就能消除内源性酶的干扰，而PAP法则困难较大。
+ H) G$ H$ h/ `$ D6 O 2) 敏感性与PAP法大致相似。
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3) 在血、骨髓、脱落细胞涂片的免疫细胞化学染色上具有PAP法不能替代的优势。
; L! ]! @. V3 o S) l2 b0 E) u 4) 反应稳定，着色清楚，背景淡。
