PCR产物的电泳检测时间
2 G4 _$ j$ k( F) i$ e一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。   w0 ^. y6 H# j$ e, a

" ~; _# j, [3 L5 J6 H, R9 K6 r假阴性，不出现扩增条带 % _5 Y7 S1 N/ v2 g$ Q, e) ], D5 j+ L
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 . U& g8 w/ R. U5 M9 W. |/ E
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 , A; U. X& W$ I2 u* E" `
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
1 Y0 b1 w4 C: J引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 # H! u/ P) m5 D3 T
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 + x8 z2 B; f; a  z
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 ( }# O0 Z( g" b% Y
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 ( S$ i3 D# R' y5 s7 [4 W. z
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
4 M. U4 h; z* v  L) x% o- R& Q* x' I) [) i8 n
假阳性 " b2 }' F  @1 a& L
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
9 D% P6 L9 T' K8 m) r引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。需重新设计引物。
; q8 F9 @2 U( d& n" u靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本 前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
! }9 K( q6 j1 f0 c
1 }* @8 ~+ I" M出现非特异性扩增带
4 n: L0 A! X; b0 x8 I' l! TPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
9 b: M: Y" O( B8 Q7 Y
' G6 O, N1 X! l* d( ^出现片状拖带或涂抹带 . a4 R' u& Q: |' l2 f
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量，减少循环次数。
/ L7 c4 Z/ d7 t$ ^) f9 F/ [" }8 P: B9 U9 X: G
克隆PCR产物的最优条件是什么？
  H$ V" C! R5 V% Q' j2 X: F最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。 9 _, d$ S) L4 a/ F, n
# |; O/ `( Z' \* @
PCR产物是否需要用凝胶纯化？
4 T" b, j& X% z& ~- M如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 5 Y9 O; c7 U) M

+ F+ V- M5 O' w1 ^, Z如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
) j9 {9 V1 U0 E- h  L6 I% dA）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
6 H1 q# f1 m; q* _  J' TB）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 5 V; s& W0 f! D+ @2 }  f* q' ]
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 0 z0 J% c0 p- ^9 Q, N- F
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 ( B8 Q) X' W- M( h+ c5 M$ W! r

9 b- y4 w8 b6 y2 S4 C对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
3 _9 J; A1 K2 d: ]- O+ `3 tA）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。 : i& C0 N3 @2 P  G" ~/ Q' X- Q
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
, D0 n/ z7 n+ @$ J2 s7 uC）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。 . ]/ Z8 d% c) J! Z9 E
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
/ O0 Q* b) R$ x4 xE）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re * L' K( x! G+ i, z+ v6 P
action，PCR)，1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增10^9倍。
+ \4 t+ `$ X- B/ f1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x10^8美元。本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。
% a# [+ o& e, _$ ?/ U, R5 p一、基本原理 0 O' {+ u) K* a" B( c9 \" }: ?
DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
4 F4 v% i3 ?( \- A9 A( I) XPCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下：
, v0 A. {. z( @0 o& _将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。 % K0 h7 h% v! P3 l
二、参与PCR反应体系的因素及其作用 5 P  |) q$ z/ c
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下： # G4 e# v5 p, p1 z8 I- k2 d
(一)模板核酸 ' d$ t8 ]; O1 ]3 T0 D
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。 ) u7 O" @- ?# f( f
PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。 7 v$ v# n8 C! t% ^  e1 a
3 N8 b! }% b3 q& b4 i# X
通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。
3 r  u5 ~( v5 n+ @(二)引物 3 ^+ r5 J$ [( J1 c
引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。 $ G* {, z* q$ d# y6 S
PCR反应中有两种引物，即5'端引物与3'端引物。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％-60％。③四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5'端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。 ( J- v4 d/ G4 U, W6 _
反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。 9 m' ^3 e) i' i& m$ a9 W
引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80℃范围，以接近72℃为最好。
/ t0 |) r- N9 z: J# g(三)耐热的TaqDNA聚合酶 # G9 {- r7 h6 V7 Z( k$ W
1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。
! ~6 Q8 y. i& j$ C' s纯化的Taq酶在体外无3'-5'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^-6次/（核苷酸*循环）。
0 `, M0 }+ ^/ O% s- r( x9 TTaq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3'端加上—个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3'端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室温下作用15-20min，3'端的A即被切去，
7 n$ B4 Q6 _2 C& ZTaq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。 $ m* y$ A4 w$ e+ L
以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。
* H4 [9 J+ l1 FTaq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在-20℃贮存。
8 ~1 y7 h, L( w! R(四)缓冲液 8 M- O2 U. C2 h5 `) P" e  a4 t, p
缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明胶(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等，认为这些物质可以保护Taq酶。
7 c5 [5 j0 H! h, w0 F' j+ D(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。
. J1 u+ w" y2 h5 X5 J为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L)，由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。
3 [  }! k: f2 `- _3 B(六)dNTP . \- ^: d7 i+ Z
dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。 " ~; I( v# ^& l
(七)反应温度和循环次数 4 L# O0 Z' @+ H/ K0 b+ R
1．变性温度与时间
' ?- W# R+ m- j- D& Y) B- c4 nPCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。 / C' S& g5 X- g! o# D( ?3 ?
扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性(94-97℃)、退火及延长(55-75℃)。
% w- t8 M/ O, L- n1 l+ s* w为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡。
" _# a; u( q# `" ]! S! }1 O: }; f2．复性温度和时间
: c$ J0 \2 H+ G2 ^1 ~复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。
! K7 T% k* O4 n: i7 ^5 ?在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特 . K9 h. P& _* R9 f
异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。
2 b; \3 v0 }; U9 R4 l- g/ k3．延伸温度与时间
  z8 l5 k, h0 M延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。
5 y0 b2 y0 z% y  v4．循环次数
$ N+ C  @1 e# P6 o9 T8 k9 E循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。
/ q/ V  {' X7 }, O1 a(八)PCR仪
* H- L* O- B$ [+ V0 c- v/ @: `, D有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。 8 i2 A" R# G! Q; P! p! f- h9 Q
由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。`

Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度 8 d$ T/ }  M# p/ w- u
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。主要是针对反应体系中的各种试剂以及环节上的优化策略更多见：

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点：1、封闭反应，无需PCR后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量 PCR是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

兼并引物（degenerate primer）PCR、套式引物（nested primer）PCR、反向PCR（inversePCR或reverse PCR）、不对称PCR（asymmetricPCR）、加端PCR、锚定PCR或固定PCR、玻片PCR、免疫-PCR

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 ( H, A8 f5 X) X! e7 }
PCR技术发展简史 & d6 r- P; E0 z# l# @  L
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
: F, O9 d/ h8 E, b: o1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
' [6 S/ `+ g& S/ n但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
$ M" ]' D2 j' E. ?' U+ v4 l9 ~) XPCR技术的基本原理和操作 5 i  w& @1 O9 @% W- N
1. PCR的基本原理 / |, v1 ]. G2 G1 Y, }' o0 s9 b
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 . W* v& p6 A& Z! ^- _  ?9 r
2. PCR的基本成分
- U- K" q. @0 }3 IPCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 . E1 m' B& ]2 ~4 `) W! Q4 f
模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。   Z) F& [% Y" W* E9 U- W
特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 - v) }, A' m+ X' Y: \' a
热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。
. a4 T1 Z) B( Y$ n脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。
8 _* s$ L1 n' Z% ^二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。 6 Z% U2 G0 W% `2 }  D0 m- ?
缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。 ! z3 V! I  b# Y1 c7 H
一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。
1 r; @: R( D2 q+ }/ ^PCR的基本操作
6 t' y! }) {- L+ K' `PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：
4 t! L! {9 u8 @6 Y  `1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2 V* y1 Z, Q* K5 A
2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； % e: o8 ]; ^1 \, G0 r
3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。
' o3 Z5 T7 y. N* f3 [% _8 X0 D以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 - t9 o) u! l9 \4 D9 i. e# [
PCR的主要应用
" R; n+ ]3 @6 c! Q( y3 G9 n! F最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。
/ ^6 W' \7 \: N" W5 H1. 基础研究方面的应用
- [+ ^6 E6 _) r  y& n. U目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：
: P8 ]" w* U# q, {4 K' `/ D, il 扩增目的基因和鉴定重组子； 2 v0 l# a9 t- ]  e0 P5 M
l 克隆基因； * T+ A6 W  o1 \" Q
l 基因功能和表达调控的研究； + u! {7 c: r% p# V2 E
l 基因组测序；
7 M7 }" g- R( W1 ]& c+ al 制备单链模板； % H$ A/ b; C7 A8 o% _, ~
l 致突变； ! a  \+ s+ H1 h) S
2. PCR在临床上的应用
$ }: R7 b' m3 O) O: ~: q# ml 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。
) g$ Y( `  [* n! D/ z. N' xl 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 + l6 [1 n" w+ g5 w0 O, l
l 检测病原体 ( d8 l: d: r. x7 q" Z- t
l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。
* z% _: i  B% N& }1 n3 d3. 在法医学中的应用
6 G, o- Q8 D& f- h; \. x例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。 5 [- T$ l) \+ _# D0 P8 l. \
所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
1 X3 M& h' k7 H: PPCR技术发展简史
! h' W! |. ^# V人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 8 n  n+ h0 ~+ t4 C( w6 R
1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 2 |3 a6 S) W. S* j
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
: P( `2 A' f+ c0 ?* y5 O5 DPCR技术的基本原理和操作
+ g0 `! ^% U' S# o2 e1. PCR的基本原理
9 Q# {5 T8 h( ^- B1 B* ^) h) OPCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
# @( ^; H- q# [2. PCR的基本成分
" J( @+ F3 l0 {; g% u' s  g4 @4 x" LPCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 - D: K  K" s. }; _
模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。
- E5 c" V& N9 Q1 q; v% I- f% H特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 - W, |! B7 R( X6 |
热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。
5 _5 Z& Y3 Q! g" ^3 ~脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。
9 B- {5 T$ j0 k3 R) Q  {二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。
: }% o& G: h& y' W, D7 S5 f' ]缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。 2 ^+ v7 b/ ~/ v' o* X
一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。
3 o- w* e% o) h+ w: G" G. C5 |3 JPCR的基本操作 + G& c6 t  b3 M) r. m( J
PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：
2 Y; y8 ~' [% X7 ]9 U1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； / n* F; o4 q. j: Y, ^
2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；
- W) |# J* ?  E' l# k1 Z8 U% W7 O3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。 , o  h9 v5 h) z5 V* O; L
以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 $ F" a" T& J' y* W8 L
PCR的主要应用
" r* v4 p3 T/ ?, f最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。
- I4 }* ]. W8 M0 V" b1. 基础研究方面的应用 8 c. p9 y; Q( K; n) L: \
目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：
- ^% \( R* s! ^+ y0 |l 扩增目的基因和鉴定重组子；
! D1 b: X& Q$ al 克隆基因； - c* Z* @- Q6 y0 }, b1 P; C
l 基因功能和表达调控的研究；
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. T. T6 s7 x3 y- i" Y3 el 致突变；
6 u% c4 S8 X5 _2. PCR在临床上的应用
8 r" c5 ?. p) f& C1 W6 H9 `8 t" o2 ^l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。
0 b" d& s4 J) m$ s8 Sl 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 / r; g4 z' X0 N
l 检测病原体 7 Y( M4 i, u, W* n; a, L) X. e/ V6 o
l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。 - [9 A9 s- m# @3 X' p& _6 L
3. 在法医学中的应用
0 q* Q$ {) o5 {3 b4 X例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。
5 e' c7 J1 l% t! p& M! |. P所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。

（1） 引物: PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。 2 o/ v* ^& A( b1 {) f0 z$ E/ @4 ]
引物的好坏往往是PCR成败的关键. 一般PCR反应中引物最终浓度为0.2-1.0mol/L。
6 g  [8 i; T" v) e. L5 R" c4 F- O$ e- q# E) S9 i
（2）4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）: 一般反应中每种dNTP 的终浓度为20-200mol/L, 4种dNTP的浓度应相同。
9 Y6 ?/ m' M8 \$ G3 @9 y) m7 A6 ^9 }) u8 p' o
（3） 模板：可以是DNA， 也可以是RNA；可以是线状或环状。一般反应中模板数量为102-105个拷贝。对单拷贝基因来说，需要0.1g的人基因组DNA，10ng的酵母DNA， 1 ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝基因时，用量更少。 8 c1 c8 A' l' L  u! G
! O: n9 P$ j/ R8 A* P
（4） TaqDNA聚合酶: 一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92 .5℃,130min; 95℃,40min; 97℃,5 min. TaqDNA聚合酶的出错率为2X10-4酵/每轮循环。在100微升 PCR反应中， 1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。酶量过高将使产物非特异性增大，过少则产量下降。 / y; }9 }* e8 h( K- F
8 O4 R, Q" W8 V5 D, C0 J3 L1 a5 ?
（5） 反应缓冲液：一般为10-50mol/L Tris.Cl(20℃时pH8.3-8.8), 50mol/L KCl 和适当浓度的Mg+2。此外，可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100mmol/L的牛血清白蛋白(BSA),以稳定酶活性
4 d" k7 W& r& Y6 O0 G  _
! k$ V6 O0 T/ b0 }6 a" L% L  iPCR扩增反应程序的设定
' N$ B  C+ ]9 Q3 m预变性：95℃ 5 min
4 ^8 u2 `/ t2 I( U8 [变性： 94℃ 1 min 6 V9 C+ M# d8 o6 A! s6 D) b1 K5 Y1 u
退火： 55℃ 0.75min 9 }/ X: s6 F# t0 x  a$ g
延伸： 72℃ 1.5min + P' a% p0 ?. J' B9 V
共35个循环，最后一个循环后，在72℃延伸10min，然后4℃保存

西安天隆科技有限公司!
0 Z: w# w7 s6 C3 q$ y" V0 y- b0 @西安天隆是我国较早从事生物学检测技术及产品研发生产的公司，公司成立十余年，一直专注生命科学仪器国产化及产业化。其自主研发、生产的实时荧光定量PCR仪TL988型具有SFDA核发的Ⅲ类产品注册证，采用半导体制冷、膜加热等国际先进技术，利用自主专利技术“光开关阵列组合光电倍增管PMT”进一步提高了PCR核酸检测的速度和精度，避免了机械扫描，保证了高可靠性。