荧光定量PCR
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荧光定量PCR原理：
' [" u# |4 l+ ?+ O3 ~9 h 荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点：1、封闭反应，无需PCR后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量 PCR是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
' F/ o+ p# t$ n/ V i 在PCR的反应体系中设计一对特异性引物 ,并在引物 3′端的下游再设计一条带有双荧光标记的探针 ,该探针能与模板DNA发生特异性杂交。探针的5′端标记荧光报告基团 FAM (6-羧基荧光素,荧光发射值在518nm), 3′端标记荧光淬灭基团 TAMRA(6 -羧基四甲基丹诺明,荧光发射值在582nm),两者之间构成能量传递。探针的结构完整时,5′-FAM所发出的荧光被3′-TAMRA所吸收或抑制,不出现荧光信号的变化。随着 PCR反应的进行，由于Taq酶具有5′到3′外切酶的活性,当合成的新链移动到探针结合的位置S时 ,Taq酶将探针切断,探针的完整性遭到破坏,能量传递结构亦被破坏 ,3′TAMRA的淬灭作用被解除 ,5′FAM的荧光报告基团的荧光信号被释放出来。PCR每复制一个特异的核苷酸片段 ,就有一个探针被切断 ,同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一对一的对应关系 ,随着产物的增加 ,荧光信号亦随之增强。在 PCR反应过程中检测反应体系中荧光信号连续不断的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7 %的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值),循环次数即循环阈值 Ct(cycle threshold,Ct)被记录下来。该循环参数 Ct和 PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系 ,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图 ,制成标准曲线 ,再根据待测样品的 Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，所以根据PCR反应液的的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
; G1 P Y5 ^& v7 M1 [# K实时荧光定量PCR原理：' r' z1 s5 B5 f* u
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
. ^( A' E3 [2 B 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
( {4 o2 ~7 \1 P4 p7 J2 hCt值的确定6 Z6 D U$ F4 o* K
荧光值的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ? SD cycle 6-15
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Ct值与起始模板的关系： 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如（图4-6）所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
! |/ u! B+ J" R荧光化学: 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
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荧光域值（threshold）： PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle 6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
8 `$ N3 i2 V5 VSYBR Green I
9 |' y: {5 i0 }/ w6 R j c" O+ N D SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
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SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。
8 [! J% L# i) h+ [+ r8 |分子信标（molecular beacon）
/ E3 L) e3 d' c6 t; l 分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
# O$ s! S8 t) |8 X# r- N2 k- ^TaqMan 探针
- J/ p% j4 ?& \3 X/ q) y, F TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
, L9 i5 C8 z" o: z' H2 l6 \LUX Primers
. h& a( G8 Q+ U H% p LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。与 Taqman 探针和分子信标相比， LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。
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PCR 产物的定量检测 R0 ]9 f; ?% \( g1 }! [
1、 凝胶检测系统 ：凝胶检测系统用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量, 放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定。最近,有用自动DNA 测序仪检测荧光标记的核酸, 这种方法可准确测量扩增产物的大小, 而且其检测灵敏度可达fg 水平, 但由于自动DNA 序列仪和荧光标记引物极为昂贵, 所以现在仅用于研究。
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2、 HPLC检测系统 ：HPLC检测系统的优点为PCR 产物不用纯化,对未标记的产物灵敏度可达fg水平,对标记产物的检测限度可能更低。HPLC 能区分不同分子的大小,可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
7 l4 l8 U5 Q D3 _3 \+ u$ d3、 固相测定系统 ：固相测定系统最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板,可用仪器比色或读数。可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板,此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量, 如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量。将生物素和地高辛同时标记PCR 产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dU TP); ②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP; ③加入生物素化引物2和地高辛标记的引物2。定量方法为: 双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物,然后加至亲合素包被的微量滴定板上温浴至少2小时,洗涤数次后,与DIG 抗体和AP结合物温浴,根据其底物不同可产生不同的颜色。亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵敏和容易操作的技术,将成为定量PCR的一个关键技术。
2 H3 q6 X3 c2 O& G4 v: i8 a% h4、 SPA系统 ：SPA (Scintillation Proximity Assay) 系统用亲合素包被的氟微球作为固相载体, 用生物素标记引物, 在扩增时掺入氚化的核苷酸, 扩增完成后,加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR 产物, 此捕获过程可使氚与氟微球紧密结合, 氟被氚激发产生光脉冲, 可用闪烁计数仪测量。与比色法相比,此法具有更大的线性范围。
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5、 杂交检测系统 ：将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面, 与标记的DNA 探针杂交,亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T ) 尾巴固定于膜上,与变性后的已标记的扩增产物杂交。在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面, 故其反应动力学接近于液相, 反应速度快。通常使用生物素化的探针或扩增产物, 用亲合素2AP结合物产生颜色斑点,通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
7 b9 ^' j* v) d. B0 R9 H Y1 c3 s6、 电化学发光检测系统 ：通过亲合素2生物素系统将扩增产物结合于磁性珠, 然后与2,2′-联吡啶-2钌螯合物(TBR )标记的探针杂交,加入三丙胺(tripropylamine,TPA )溶液,并转移至电化学发光仪的检测池,当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化,TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质,可与氧化的TBR反应,使之进入激发态,当由激发态变为基态时可发射出620nm的光。发光强度与TBR标记物的量成正比,通过发光强度对PCR产物定量。此法的敏感性很高,可自动化测量。
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7、 DNA酶免疫测定系统 ：通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合, 再通过酶-第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记, 但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
: @7 v5 n( o6 V6 O3 k8、 激光诱导荧光检测法 ：首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨己基连接臂偶联于正向引物的5′-核苷酸上,然后PCR扩增,用毛细管电泳扩增产物,最后用氩离子激光光源检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少,可自动化检测, 快速、灵敏和高分辨率。
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实时荧光定量PCR的特点
5 B/ B% @" L2 K! u7 y. r1. 敏感性 实时荧光定量PCR技术的敏感度通常达10?拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。同时实时荧光定量PCR应用了光谱技术,与计算机技术相结合有较多的优点,有效的减少了劳动量。如Taqman PCR使用氩激光来激发荧光的产生 ,利用荧光探测仪检测荧光信号的大小,通过计算机的分析软件进行分析,灵敏度达到了极限 ,可以检测到单拷贝的基因,这是传统的 PCR难以做到的。敏感性大大提高。
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2. 特异性 实时荧光定量PCR技术具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。荧光探针的使用相当于在PCR的过程中自动完成了Southern印迹杂交,进一步提高目的基因检测的特异性。
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降低产物污染的风险性 传统的PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果除了有污染外,还对人体产生一定的伤害 ,而荧光实时定量PCR在全封闭状态下实现扩增及产物分析,有效的减少了污染及对人体的伤害。在大批量的标本检测中能有效的减少劳动量。
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3. 可重复性 实时荧光定量PCR技术结果相当稳定，同一标本的Ct值相同，但是其产物的荧光量却相差很大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，Ct值与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比Ct值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。同时，因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，如扩增孔间温度差异、标本中DNA聚合酶抑制剂的存在、加样的差异和待测标本中核酸模板的量等。因此，在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。
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4. 实时荧光定量PCR技术是将PCR从定性检测发展到定量检测的重大飞跃 ,这无疑扩大了它的应用范围 ,也提高了其应用价值。与常规 PCR比较起来 ,它具备更为突出的优点 ,近几年国内外医学临床和实验中报导了Taq Man技术的优点，它具有良好的敏感性和特异性。特异性方面 ,用以检测病原体的拭子样品,应用 Taq Man探针和常规PCR比较,特异性分别为96.5%和92.9 % ,检测外周血样品的特异性为96.7%和95.6% ,特异性之间的差异无显著性( P >0.05)。敏感性方面 ,Taq Man技术明显高于常规PCR。据陈效友等试验结果,纯化的结核分支杆菌染色体基因组 DNA经751型紫外分光光度计定量 ,从 100ng/μL开始,10倍稀释至1fg,并对结核分支杆菌菌体进行10倍稀释 ,分别进行Taq Man-PCR检测3次,结果显示 PCR的检测灵敏度达1pgDNA和20个菌体/m L,而Taq Man-PCR的检测灵敏度达10fgDNA和 1～ 5个菌体 /m L。也就是说 ,Taq Man技术的检测灵敏度要比常规 PCR高 10～ 100倍。德国的B.Schweiger等用Taq Man-PCR检测流感病毒 A、B型和 15个亚型中,100倍稀释时,灵敏度可达0.1TCID50,近似10个病毒 DNA,而常规PCR约为100～200病毒DNA。Taq Man技术的优点还在于由于全程的闭管操作,没有 PCR的后处理过程 ,因此污染率降低,克服了常规PCR污染率高造成假阳性的致命弱点。又由于其标准曲线的动力学范围广 ,为精确定量提供了较大的可信区间。 Taq Man技术采用的是外标准曲线的定量方法 ,它比内标法和半定量法要准确得多 ,而且 ,荧光探针高度重现性的特点保证了定量检测的稳定性。另外,定量过程的全自动化、高效率为其商品化提供了可行办法。
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5. 实时荧光定量PCR技术使用了“内对照”系统 ,可校正 PCR效率获得定量结果。实时荧光定量PCR技术使用即时法 ,有效地解决了传统定量只能终点检测的局限 ,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件中,Ct值代表样品的浓度 ,通过对每个样品 Ct值的计算,常规法须在 PCR完成后测出全部的 PCR产物量 ,再确定原样品浓度。实时荧光定量PCR技术无需内标而采用外标准曲线定量 ,其原理根据 Ct值的重现性以及 Ct值与起始模板的线性关系。用实时荧光定量PCR技术检测,循环数约 20～24个 ,而常规 PCR法需使用 34循环。
# P6 k; m8 _, |' \0 Y6. 然而 ,Taq Man技术也有其不足之处尚未解决 ,如假阴性结果,这有可能是由于扩增体系中存在抑制物( inhibitors)而导致的结果或由于部分病原体存在序列缺损,这些问题有待进一步研究。另外,Taq Man荧光探针采用了酶外切活性,因此定量时常受酶性能的影响。
8 ]1 |, v2 v# J0 d. [8 F$ d实时荧光定量 PCR技术的应用
$ Q0 e1 b# ~" H9 I5 E) N& f) j4 Z 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：
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1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。
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2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证。
" @) m, u( Y+ E3 Q% U' E1 W3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。
0 v( A/ C; o4 k9 ?6 D随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。
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应用实例：" A B2 j- f! J
1. 病原体测定：
\- S8 a! Z& f3 L# n: q5 Y 由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 Morris等[3]用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。与巢式PCR比较显示，FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。另外，还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种检测方法均为阳性，10例均为阴性；另有6例用两种方法测定的结果不一致。该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR方法重新测定，其结果与FQ-PCR测定的结果一致率为100%。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。
7 T7 Y; N% t* k2 @0 W8 J 发现由于荧光探针的应用，对各型HPV的检测变得十分方便和准确。由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配，用一般PCR方法扩增时，如有HPV-66存在，即可扩增出HPV-66片段而发生误诊，但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。因此，FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在TaqMan系统中却可检测到。对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100～1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组，平均每300个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组。
- O9 P& c/ o+ k7 N# w2. 肿瘤研究：
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意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。
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1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。
' m1 \/ W; O1 W+ t! _- ]3. 基因表达研究：
" q' |- m) O) A$ \ 由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPO mRNA水平明显升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的浓度与其 mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO 的作用提供了依据。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。
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4. 免疫组份分析：
$ a1 d @# }9 Q0 }- k% k 对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等[13，14]，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
! u8 O' N, J$ L6 k3 g" a: N5. 基因突变及多态性的研究：
+ W; z9 S+ t# S 美国Ibrahim等1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。
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其他方面
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日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。
