PCR反应体系与反应条件
* q" a1 b" e- X: U. }PCR反应体系试剂：
1 j& L" D0 Q5 |2 U2 Q1、 反应缓冲体系：提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8~7.8之间。一般体系为：500mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl。Tris-HCl用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCL有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl对Taq DNA聚合酶有抵制作用。
' l- w6 |2 K2 B2、 Mg2 : 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影响反应的特异性和产率。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度。Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的，故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性。通常Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2－2.5mmol/L。对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
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3、 Taq酶保护剂：一般用乙酰化的BSA（小牛血清白蛋白100μg/ml），起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性及保护作用。或者改为5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)。另外加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利。保护剂还有明胶(0.01%)和Tween-20(0.05%~0.1%)。
; t( a7 B# @( `: f6 M4、 三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，小量分装， -20℃冰冻保存。经过两次冷冻-加热循环，会使dNTP降解，储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。在PCR反应中，dNTP应为20～200μmol/L。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低，降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。DNTP会络合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制Taq DNA聚合酶活性.理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段.
1 y$ ?3 K$ B# I7 p! p7 I5、 Taq酶： Taq聚合酶相对分子质量为94000，其最适pH值为8.3～8.5，酶活性较高大约为200000Umg，Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是72℃，转换数Kcat接近150nt，这种活性有明显的温度依赖性。目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，但保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。通过遗传工程，已获得了高保真度的Taq聚合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。另一种为大肠菌合成的基因工程酶。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。TaqDNA聚合酶虽然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定，保持着催化DNA合成的能力。有人试验证明在92.5℃,95℃,和97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95℃（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80℃时，dNTP的掺入速度为35-100nt,最长延伸长度7.6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70℃的延伸率高于60nt, 在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0.25和1.5 nt。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90℃以上）时，很少能合成DNA。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80℃，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5～5个单位/100μl，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
0 d: O. Q( e5 F: o6、 模板：PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，需先经过逆转录生成cDNA然后才能进行PCR反应。含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好). 由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般不要求很高，某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在如：蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；二价金属离子的络合剂（如EDTA）等；会与Mg2+络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。
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7、 引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，但浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算：
( q4 q% N* Z2 r; l8 B$ j* oEM=A(16000)+G(12000)+C(7000)+T(9600)
1 Z- L8 |; H6 ]- z; H: S# a8、 PCR促进剂：
! g( h4 `1 r8 o9 c9 `7 t: Y" B& ^
据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。
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几种常见的PCR促进剂：
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1) DMSO：反应体系中加入5－10%的DMSO有利于DNA的变性。使用DMSO对大肠杆菌的DNA聚合酶的Klenow片段是有益的，但是对Taq DNA聚合酶具有抑制作用。
" Y/ @ ?6 f& j9 M3 }& Q
2) 甘油:反应体系中加入5%~20%的甘油有利于DNA的复性，尤其是对富含G+C的二级结构以及长片段的靶序列的扩增更适用，但需要注意甘油并非对所有的PCR都有益。
/ ~" T( z8 G$ E, Q- @* b3) TMAC:在反应体系中加入1×10-4－1×10-5mol/L的TMAC可以去除非特异扩增，不抑制Taq DNA聚合酶活性，促进PCR。
. P4 ?, R# U# e( ?' r/ R V
9、 标准的PCR反应体系：
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10×扩增缓冲液 10ul
3 n+ b$ \6 q# P& f2 P 4种dNTP混合物 各200μmol/L
& ?; Z. x% z/ E) U6 A) A+ Q: E 引物 各10～100pmol
: ]# _1 @+ ?7 j 模板DNA 0.1～2μg
) `1 J9 {- f/ g0 f# C
Taq DNA聚合酶 2.5单位
4 k. u% B; r' B r6 w
Mg2+ 1.5mmol/L
1 ]" {9 h7 Z" W& O) ` 加双或三蒸水至 100μl
6 \+ @) `; V( g/ j
/ n* y9 c" N5 P
PCR反应条件调控：
# c- }5 \; n( V+ _. p n, P+ v1、 温度与时间的设置：
# P3 C% O0 K5 Z" h1 i9 @, H8 ] 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
Q& W; x) q5 n- L. N$ }1. 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下93℃～94℃1min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。
4 ] ^3 \/ w2 j. ?/ W2. 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s，足以使引物与模板之间完全结合。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
! }- M5 o4 ^2 x8 ~) h
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
+ s$ q" \7 V* ^+ {; E: _. y【引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度】
, B6 E: P7 O5 w. z0 \* O 较高的退火温度可提高反应的特异性。在Tm值允许范围内，应尽量选择较高的复性温度。
$ \; L5 q: W/ Y$ ~7 i! q6 }) P0 q
3. 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子；70℃ 60核苷酸/S/酶分子；55℃ 24核苷酸/S/酶分子；高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
# S" O' b1 u S% S7 ~) v
延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
: I# n9 S( W1 C8 n0 p
2、 循环数：
( j' l2 a% v$ m3 B$ B 循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现；循环数太少会影响正常的PCR产物量。常规PCR一般为25-40周期较合适，具体要多少循环数可通过预试验确定。在其他参数交已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，模板DNA分子数 需要热循环次数参照：
. M6 N* B9 M, [+ I w1 V
3．0×105
) ?2 o6 G! _8 l) i25－30
( d8 [* p0 R6 L7 [4 X6 l: B& m1．5×104
9 Y& G) K( a/ C30－35
$ h8 G3 A6 W; _1．0×103
& y# N* {8 M- \! c+ D0 [' f) d6 H35－40
4 }: A2 Z- L" e I E* m50
4 }* r1 T. F3 P- x% }40－45
# K$ m K z! E( @ \- H3、 PCR产物积累规律： , m; ^- h2 O% w9 v w$ T) [
反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关.
3 Y* H' p+ |1 p4 l7 P. e- UPCR操作程序：0 P/ {' M. E' x& R
1、 向一微量离心管中加入如下物质：
8 g6 S8 p3 [7 j! P
10*buffer 1/10体积
- `6 b6 }; B4 L9 S; H! B, D DNA模板 10-10拷贝
1 ?4 A. H: Z& o
dNTP 各200umol/L
" i4 D( C9 \+ _6 j: L 引物（一对人工合成寡核苷酸）各1μmol/L
5 @# ^7 I/ U! r1 H* z
ddHO补至终体积（终体积50-100μl）。
3 r# }2 a- t5 w/ O 混匀后，离心15秒使反应成分集于管底。
) B6 \- ^7 `# k2 G2、 冷至延伸温度时，加入1-5单位TaqDNA聚合酶，在此温度下作用1分钟。
- J: A' ~# a/ o8 _# w0 i; P
3、 DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA.把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。
( u# f) {5 ~; E; z
4、 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。让样品的温度下降到50－65摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。
7 g$ |; B% s; M( c8 Y5 j* ]
TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.......GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
1 j7 a4 D W3 F& x
Ataagcccgaaaggttcgtt
9 m. u& u F' \, ^ Tatccaacggctaggcattt
% y: }: B. |# D7 `
ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.......CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
) R9 }5 z8 Q6 W( h0 K9 d
5、 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。让样品的温度上升到72摄氏度一到数分钟，DNA聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。
1 o4 o6 S& U" y, ~
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6、 重复4-6步25-30次，每次即为一个PCR循环。
) [0 J" z3 ~. f. Z, w) H7、 检查扩增产物。
