DNA提取

主要内容：
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• 基因组DNA提取方法
• 外周血DNA提取技术
• 真核细胞DNA的制备
• 植物组织中DNA的提取
• 细菌DNA的提取方法
• 石蜡包埋DNA提取试验方法
• DNA提取其他方法
• DNA含量的检测和纯化
• DNA提取的注意事项
• DNA提取常见问题分析

声明：' Z" x" T) i! c( U
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致谢：+ z2 Y( c3 u7 [. V# a; E
整理者：WANZHAN   审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige888 I' Z0 }' h6 T- _, l
主要参考资料：《分子克隆实验指南》
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石蜡包埋DNA提取试验方法

  I. }, B* X2 r
试验原理：* N9 v) s% y% m& p; v4 X+ W0 _3 K% P
　　从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
5 R. {9 r* l9 b试验试剂：4 e; \9 g; t4 q: @) _" N/ j
20×SSC 配方：3mol/l Nacl ，0.3 M 柠檬酸三钠·2H2O ，用HCL调PH值至7。0 : o5 I$ ^+ P: \
石蜡消化液：150nmol/l NacL：15mmol/l柠檬酸钠，1%SDS，PH 7.0。
. @* I5 _; D4 l" y  R5 x试验步骤：
( v+ F4 E2 Q6 Z( J( a' c! r( h- m1、 取蜡块切片15-20张（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。
5 h% d! j4 I0 d  E: y9 v+ y2、 剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。
, K$ D# Q; b& y. s; d! G3、 消化：以1×SSC 500μL加入SSC 洗涤沉淀，以12000rpm离心3min。弃去上清夜，干燥沉淀。加入石蜡消化液 400μL，PK（20mg/ml） 20μl；55℃消化120h，第四天，补加PK 10μl。
+ v: Y7 X( Z: p4、 ?消化后的液体很清亮，肉眼可见的组织较少。将其转入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以灭活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷却。以10000rpm，离心5min。
/ q* p$ M" Y" L8 U4 `* `5、 取上清加等量的酚-氯仿，轻颠倒混匀呈乳白色。低温下以14000rpm，离心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重复上面的步骤。
/ o: r- a( E2 c# ]* S. i8 `3 N0 c6、 ?取上清加入预冷的两倍体积的无水乙醇及1/10的乙酸钠（PH 5.2），颠倒混匀。置于-20℃，30min。低温下以14000rpm，离心10min，去上清。
5 a% L* U# n. u7、 沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤2次，（颠倒eppendorf管数次）以14000rpm，离心5min，，自然干燥沉淀。 + T5 Q6 i& ^3 y% e* G9 I
8、 加TE  20μl，（含RNA酶），4℃下过夜。
/ f* S' U$ \3 F注意事项：1 _9 }! g: L% K+ r: s6 K& z
1、 取材时应避免出血坏死的组织，尽可能选用新鲜的标本。
2 _6 t' ^; y5 d2、 消化时应不时震摇离心管，使酶与组织充分接触。! q8 k8 @& }5 _+ Q1 r$ @
3、 福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，匀浆的效果往往不理想，可将组织切成10um的薄片进行消化。: [- e* h; a7 O" z
4、 消化不完全，可采用高浓度蛋白酶K及延长消化时间。
+ U- @  {' T6 R附：elz氏DNA提取方法的主要步骤：
# j. W/ Z1 u" M. Z8 r　　TE9提取液的制备：500mmol/L Tris 20mmol/L EDTA  10mmol/L NaCl  1％ SDS9 }0 `& e) T) k5 o1 {. ^3 W
500 μg/ml 蛋白酶Ｋ  pH8.0
$ i$ g2 H9 m7 F* {5 ^; U0 m2 K2 d1、 切除多余石错，暴露组织。将组织切碎（最大径<0.5mm），称重。' H3 x( }- l0 b* C$ t9 |1 P" p
2、 溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h。
3 t, z& r' i! n3、 再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。8 X) F8 q) \8 I. E! v5 j
4、 用等体积酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍体积乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9 000rpm离心１h。6 C4 E" s0 q( r% }: Y7 \) o! ^% j+ D# I
5、 沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

% ]' V1 c% s4 [5 h" t5 B. H4 Q适用于PCR研究的快速提取法：
/ S* V6 }7 Y; {  V0 k) A  x- Z# a试验步骤：2 g+ f, ~0 p  T# |: }6 p' }  q
1、 田间剪取植株新鲜叶片5－10mg（约2cm长）左右，新鲜叶片放于15ml离心管中，存于冰盒中，根据样品号贴上相应的标签。
+ D$ A  e6 a% j, [, U9 O2、 用剪刀将叶片组织剪细（约0.5cm长）放在点穴式研板中。加入400μl DNA提取缓冲液，用玻棒将叶组织研细，直到液体变成深绿色即可。
3 a6 n) S  z0 x- k  k3、 加400μl DNA提取缓冲液，混合均匀，转入一新的15ml离心管（贴上相应的编号）。! i. G  Q5 v$ m) i! f# _
4、 加400μl氯仿，混合均匀后，2400转离心30s，将上清液转入一支新的15ml离心管（贴上相应的编号）。
- L# w* D, A8 ?5、 加800μl无水乙醇，混匀，2400转离心3min。弃上清。70%乙醇冲洗，风干。用50μl TE缓冲液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。; r$ Y+ w, F6 g

, s" `+ L% ]; kChelex-100法提取DNA：3 |& \* E1 r; v# K% ?/ D2 ~& F5 q& v
试验原理：
8 I8 l& k( B1 A1 k. R  n! }　　Chelex-100是一种化学螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲合力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，DNA游离。Chelex-100特别适用于微量生物样本的处理，方法简便快速，提取过程始终在同一管中进行，不用转移，可减少DNA的损失，操作步骤简化，减少了污染的机会。" L7 q8 s# I- V* e* F7 d) V7 J
以血液为例实验步骤：8 @) Y& p" \( b9 h! P+ ?( z& S2 C! ]
1、 取血液1-3?l，置1.5ml离心管中，加灭菌双蒸水1ml，振荡混匀，室温30min，或置冰箱-20℃ 5min。# c" y& N$ F+ c( H+ D% ]
2、 10000r/min离心5min，弃上清，反复2-3次。
- ~, s, K9 u0 Y: d0 V) Z( C: \; J3、 于沉淀中加入200?l悬浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴过夜。
  h' n* Z2 ]" `" i' P. I" [4、 振荡5-10秒，置100℃ 5-10min，取出振荡溶液5-10s。
" l+ y: [3 |; M* V% ^5、 10000r/min 5min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。
5 A. _8 o/ I( v3 W* f- ?6 K% U注意事项：
' p6 C. o# k6 H) e1、 Chelex-100处理模板仅适用于PCR反应，处理液不宜长期保存，如果保存的时间稍长，可将上清液转移至另一管中保存备用。一般在一周内使用，如果保存时间过长则会影响PCR扩增结果。" ]" E( \+ e/ B
2、 在处理模板的各个步骤中，振荡要充分。
. F, ?5 u4 E, f/ I! r6 l3 N3、 煮沸的温度、时间要充分，否则将影响扩增。
6 X9 ?9 H' x8 G4、 使用前要混匀离心，取上清液作为模板，如果PCR反应体系中含有Chelex-100，Mg2+会被螯合，降低酶活性，使PCR扩增失败。7 t5 u: \6 ^  V
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硅珠法提取DNA：
' `# b4 K+ t% N" h试验原理：
+ i1 T8 j- N/ N- y　　在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，DNA能够被二氧化硅特异性吸附，当没有硫氰酸胍存在时，DNA又可从二氧化硅中释放出来。硫氰酸胍是一种高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质及一些不溶的物质除去。吸附后的漂洗过程则可将溶液中的PCR抑制物洗去。
# ?- N) e! w  [8 d  C& q0 ?4 u6 u试验试剂：
. }( i( u# l) x0 }6 U1、 吸附剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，0.8ml 0.5mol/L EDTA，0.5ml TritonX-100。
, I1 M' ^( Q9 I2 U2、 漂洗剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。5 N( M! s7 I5 u0 n3 B
3、 硅珠悬浮液：0.06g Silica溶于1ml灭菌超纯水。
* k1 y- t7 ^( T% X( y/ U& u/ l2 m4、 TES：1ml1mol/L Tris-HCl pH8.0，2ml 5mol/L NaCl，2ml 0.5mol/L pH8.0 EDTA，95ml灭菌超纯水。5 I# |( h, N5 Y7 ~7 ~
试验步骤：* Y: C* [2 S1 k5 v& S+ v
1、 取1.5ml离心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混匀，煮沸5min。1 m/ b( h& t6 W
2、 振荡混匀，加入300-600?l吸附液，混匀。
0 ^! J4 a! @. k; l3、 加入20-40?l硅珠悬浮液，振荡混匀，置室温15min，振荡5s，10000r/min离心2min。
) @) T6 o$ D2 Z+ D4 n2 ]% e8 C4 g4、 除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分悬浮沉淀物，10000r/min离心1min。: o1 j+ p) O$ O& ]3 }
5、 去上清液，重复漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min 5min。. W# }2 c$ f. S" b6 Q$ f) c2 u
6、 去乙醇，置56℃　10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋涡混合30s，56℃保温10min。7 o5 {2 w" v1 \. u6 ~# ~, Y
7、 10000r/min离心10min，上清液可直接用于PCR反应。, t: S# v# ]% }# H+ F
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固相吸附法提取DNA：
2 I! M2 z2 L0 ~( r试验原理：
, q# l1 x- o# i: C9 N- M9 n/ v" Z　　硫氰酸胍具有溶解细胞和灭活核酸酶的性质，利用当硫氰酸胍存在时硅藻颗粒能特异性吸附DNA，而当去除硫氰酸胍时，DNA又能从硅藻上释放出来的特性，来提取样本中的DNA。该方法尤其适用于临床标本的DNA提取。$ _- t0 h1 B, L- s! H& k/ N) a3 y
试验试剂：
2 z3 r8 S: P' a' c9 J5 Y1、 裂解液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4，2.2ml 0.2mmol/L EDTA pH8.0，0.3ml TritonX-100。
+ H( j; D0 L: x1 X2、 洗涤液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4。3 I& e! ?- m( ~5 F6 C- ]5 f
试验步骤：. _( l7 V. G! A! Y: D$ q9 g4 \% U  G1 [6 m
1、 取100?l样品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振荡混合，10000r/min离心1min，去上清。
! T' @9 q- j" W. s4 j6 C2、 加1ml洗涤液，悬浮沉淀洗涤，10000r/min离心1min，再重复一次。加1ml 70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃　10min。
! @6 Y$ K4 J: p2 b7 V0 `3、 加60?l TE缓冲液混匀，56℃　10min，10000r/min离心5min，上清液备用。

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