质粒提取

( Z7 _9 W% b6 h主要内容：" T; K9 |) r2 C% F! o8 s

+ \  T3 u# e$ T7 l+ K$ b

• 质粒提取原理
• 质粒小量提取之细菌的培养及收集
• 质粒小量提取之煮沸法
• 质粒小量提取之碱裂解法
• 质粒的大量提取之细菌的培养及收集
• 质粒大量提取之煮沸裂解法
• 质粒大量提取之碱裂解法
• 质粒大量提取之 SDS裂解法
• 质粒DNA纯化
• 质粒提取常见问题解析

5 Y4 {) c2 q7 i声明：8 M: e# ]  ^; M4 a  e' Z: y/ y
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5 Y5 D. Z& _( V6 L4 m致谢：) a9 i; m$ F/ A; F; b. f
整理者：WANZHAN   审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88
( @+ u3 }2 h2 Q0 ]& {$ j- i- O, i" `% v主要参考资料：《分子克隆实验指南》
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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:05 编辑 ]

质粒提取原理
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       质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
* J5 u1 i9 f- ?7 a$ }9 y- G1 c# w+ l       从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。1 t' J) l! c& H/ L
       在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。( b" d( a2 Z3 l
       质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。 由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

质粒小量提取之细菌的培养及收集
6 }. g6 ?. U. T

试验准备：
1 V5 O. ]( W, [( B1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。  M0 W) L% o) [' a8 ]
2、 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。; I7 ?( K* q4 |+ Z: a
3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。: z( I5 i% t3 N9 y3 T0 O& h
试验步骤：7 a& `' s  g1 V7 O- H
       将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
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! z7 @, ~: M. a: B, |[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 20:26 编辑 ]

质粒小量提取之煮沸法6 j$ J8 @5 j# ?; B1 |+ `

试验原理：* S2 t8 s7 r- N8 j4 x
       煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中， DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度， DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 - h. }+ ~: z. v/ W1 M
        琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
. z3 D2 W; X  A* [; ?       在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 2 _+ ]5 J( w% |6 U, [  p& l
实验准备：
- b, H, b) M, u1、 70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）
4 x5 I2 h! y7 F0 w$ g& v3 C2、 STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）
' o' ?, g; u- _1 ^* r" i3、 1.2M 氯化钠 / Y" z, l/ l. W) v) y. J, d  @5 |0 H% \
4、 TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ） + F' x8 U% P& I; X' p
5、 STET:0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），5％Triton X－10（其他同碱裂解法）( J% I" G/ b# Y0 {# z' x3 g/ t0 u! g" l7 N
试验步骤：
# ?4 w. s; q( h9 t/ l* _; C/ g0 C1、 无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上10000rpm离心1min，或者以
) z' w# g. S. y      4000rpm离心5－10min，弃上清液，倒扣于干净的吸水纸上吸干。
7 l* |# n, Y; @/ z- S2、 将菌体沉淀悬浮于350μl STET缓冲溶液中, 涡旋使其混匀。
! |1 [, i/ \, t. g7 @3、 加入25μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制), 涡旋振荡大概3秒钟。
& z2 Q* _1 }' a- K" q8 t! a4、 将eppendorf管放入沸水浴中,40秒后立即取出。
& h' g+ ?' n, ~# J" C5、 微量离心机上以4℃，12000rmp离心10min。  o* s+ j- @/ c# Q5 q8 j" [
6、 用无菌牙签从eppendorf管中挑去细菌碎片。 5 I0 g8 [4 T2 z9 P9 c3 ]% N# C
7、 在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置５min。
- h' @* e7 w8 Y" n- [+ R8、 微量离心机上以4℃，12 000rmp离心５min，回收核酸沉淀。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，
8 H* H8 i, K7 ?+ m$ t. S* `- c       以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。（可参考裂解法中的做法）。
7 w7 ?! o5 c0 |' A" O( |* J9、 加入1ml７０％乙醇，以4℃，12 000rmp离心２min。轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，有时沉淀块
5 S. p9 x  d( ?% a$ w8 _) f      贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止
; @5 T0 S$ t# V$ z( S8 O     （大概需要２－５min）。! v# E1 s. q4 D/ _" N$ U
10、 用50μl无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡即可，贮存于-20℃。5 V) r) X1 D6 Q3 [$ k6 ~  {" o
注意事项：
* w- L% w3 W% b7 x2 K1、 大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。0 s! f' C0 Q2 Q0 k, V7 Z
2、 添加溶菌酶一定要有限度,浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同溶菌酶也能溶菌。) S. w/ g' J: m* ?! w* j1 ~
3、 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。3 `, p4 M( Y( O( O8 I
4、 试验步骤中的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。$ D: ?( y" l' v; B0 A3 B
5、 用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液一起倒掉。+ |% R/ u! Q9 M- b1 W( ^: I
6、 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 1 H9 {0 L8 r9 y6 y
7、 当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA时，建议不用煮沸法。因为煮: C6 J  n/ J! m3 E
      沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 若要避免6 v. I' R8 ]+ b8 C
      这一问题可以在用70％乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。
& k. v( _$ f# x8、 如果要通过限酶切割反应来分析DNA，可取１μlDNA溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl 10x限制
& C( a. w/ |3 _$ F$ H8 b' a      酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温度温育１－２h。将剩余的DNA贮存于－20℃。通过凝胶电泳分析经
6 s. B; I- I, U& M      限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤中未能很好地去除
, Y& L( _" E" D" ?, u      所有上清液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提DNA终产物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍过
, J/ i6 g' g+ y$ i, y& V$ L      量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的
) V0 ]5 ?. J: g9 I      困难。消化后， 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2)和２倍体积乙醇沉淀DNA。

质粒小量提取之碱裂解法
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试验原理：
9 c0 B  f4 P1 Y' J       碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。4 `1 Y7 t- h# k' `8 O+ u* b/ C
试验准备：0 g) `$ r/ P: E5 `
1、 溶液Ｉ:pH8.0  GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/i
5 D' [  Q' ?" X# d# W       n2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子
- k6 ~# M: F3 n& U1 Y       的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2 ＋等二价金
  h3 e6 q8 }$ o* C7 R% B* [# n      属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase( m( x6 {8 V7 E1 g8 t
      对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。# ?  b9 x( }! ]  B; @
2、 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的
- [' E5 P. B$ G% Y       CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶( S/ _+ k% f9 J& E3 I/ I
       解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，
* z  x- v- ~' X* f2 P. Z- E! J       即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋  q, w2 J% m/ a! t5 \
       白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白. b" D6 D; m$ T
       质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步7 v+ J6 a+ c9 S5 d# y' X$ n0 }
       试验的更好进行。
( l$ J% u& ~+ F+ [3、 溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根
4 K& g: M( ?4 J( p9 n      离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存
# O  ?7 E) b' N4 k) Q; V& V: y8 H      在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分
1 k  d3 S7 e7 S. o# ~      子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而* s! v3 w/ R( \; b: a
      互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。
$ p7 ]: M) }  M$ t4、 异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀" Q  }6 p5 f3 z/ {2 v$ g3 D- r7 P
       DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。
7 {  H. P2 N2 l! A4 W- ]' Y3 Y# S0 }9 P$ e9 ~5、 无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学; j0 n' I6 @9 t( u. B4 B
       反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是
& t' K% H- G; l       加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。也可改用95％乙醇来替代无水乙醇。但是3 E$ U: b6 a; s3 [) s. n- T# b
       加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀; X+ m+ p. G! U  `! V/ H! J
       时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水" A& ~1 v3 a0 [+ e" U9 K9 R
      乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30min即可。但因为使用异丙醇时常% L: k  }5 |3 J' S: s& W& D- w0 N
      把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。
, O0 t+ H4 B" r' z6、 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的- Y3 _: [7 Q4 S4 ~8 ]
      主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等! G/ g+ C4 d* d" n2 ]% ~& S
      虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将" u, `2 d. C. n7 k+ |* X
      与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓 $ v* \9 `' ?" [( p: P2 }6 ~0 k+ _
      度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的# \$ i  z( H, H2 A- I. a
     干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有8 q6 W9 x/ v0 p
     一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。
7 p+ A/ Y. @9 d     用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游 9 V7 R  g% m2 L6 V- W& s
     离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
- s6 h$ h7 u' c  O5 |7、 70％乙醇  L, ]% N7 E1 B
试验步骤:
, ?( {( D: N; \- {1、 无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000# k1 b) [5 M  t+ O( K# X
       rpm离心5－10min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。
# ~- @  X7 W4 z& s/ d# ]2、 沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置
' w6 l# @( h' H! T/ G6 M# x       10min。" ^" ~& u5 j( i/ ?9 M$ @
3、 加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。  A. t9 j: U9 S, q
4、 加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min 。$ f/ \. q- r0 X1 K7 e  @
5、 微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。/ Y5 E" x- m5 d2 s# `  m& d
6、 上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。{经验之谈：如果选用
$ T) P6 Z( V+ ~2 Z" [       宿主合适的话（如DH5a、XL1-blue等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇
% q3 S0 I6 g6 u       沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、3 B' b9 d. T7 j" v0 N7 M
       转化完全没有问题。仅供参考}# O6 c2 [4 ^( t: x2 g4 k
7、 小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。
$ t% d2 v& v! G4 J& b9 [8、 小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀, 4℃离心12000g×5min。! c- _# W( C4 [9 t  x- J
9、 上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。
" N; y  _$ @# ?' E1 w8 B/ b10、 1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次,沉淀在室温下晾干。
% E0 n, Y6 q  D: t6 x4 C11、 小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管
8 \# j& ?! Y/ v# i        壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核0 `( n+ D9 X( k2 V0 M
        酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。' @4 y# Q/ {4 X
12、 加入50μlTE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。
1 h0 V4 J. `% E7 D' [# i$ w注意事项：
8 C- j' t$ u6 a  W+ F# j       提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。

质粒的大量提取之细菌的培养及收集

' B; W, U' K. i" j/ s　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
: Z$ H0 L" I7 L. s. ?/ w9 n　　许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pＭＢl或ＣolEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物２－５mg质粒ＤＮＡ，而且重复性也很好。
' _' p+ ~& s$ ^1、 将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从  p0 ]. m( e- k. b& N
      单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。' P5 }4 [, z; S) w  M" P7 u
2、 将含相应抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）加入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振
, s) v9 Y4 z: m( L7 b      摇培养2.5h（摇床转速300转/分），所得培养物的OD600值约为0.4。
3 S6 K6 l& W/ E9 ~, w. e/ V- J, P3、 可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170μg/ml。有些质粒只要生长达到，新一
  Y7 D8 Y1 B; l      代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数，因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复2 D- C* F. r" J4 Y
      制质粒，有必要扩增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极
8 E  Y( C$ G) {9 `- u, ~$ \# v- }      大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素: m7 `/ J6 l+ a
      处理还是利大于弊。. B3 [8 v" v. b( P( t, y
4、 于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。
$ q) v8 l: K9 t( w/ C- u5、 用Ｓorvall ＧＳ3转头（或相当的转头）于4℃以4000rpm离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清
, J, y. E7 b% n& ?      全部流尽。将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的ＳＴＥ中。【STE：0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L E6 ]7 o0 {8 K% \+ ^2 o  ]' J
      DTA(pH8.0) 5% Triton X-100】按照前面所述收集细菌细胞。
2 l; h3 y2 I2 u$ r% C- {
# R7 Y$ v% \" `: m+ k" v/ b[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 20:32 编辑 ]

质粒大量提取之煮沸裂解法

0 n, ~- Z, ~. W2 K  K
　　该法[根据Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修订而成] 可与随后的纯化步骤如氯化钯－溴化乙锭梯度平衡离心等步骤联合使用。建议该法只用于经氯霉素处理的培养物，未处理的培养裂解后过于粘稠，不利于操作。当从大肠杆菌ＨＢ101或其衍生质粒（包括ＴＧ1）中大量提取质粒时，不宜采用煮沸法。这些细菌释放大量糖类，在氯化铯－溴化乙锭梯度中与闭环ＤＮＡ形成密度大致相同的区带。这些糖类还抑制以ＤＮＡ为模反或底物的酶。
* d5 l/ n* l3 @" u* L# Q" Q7 R; |试验步骤：' r! @) E- X5 m. ^8 [4 |$ Y
1、 将500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于用冰预冷的10mlSTET【（0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl（pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH 8.0）】中。将悬液移入50ml锥瓶中。
0 X- }. h' u7 \0 ?2、 加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉淀于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。
5 Z4 \$ k5 R8 Y5 t& K$ p3、 用一个夹子把锥瓶放在酒精灯的明火上加热，直至液体恰好开始沸腾，不停地摇晃锥瓶。. w# K% A. E% Q4 K" O
4、 立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯（2L）中，将瓶放在沸水中，时间恰为40s。
/ O; X* y* L  i9 j- o8 R  g, P# \/ @' v5、 将瓶浸入用冰预冷的水中５min，使之冷却。' s3 G, I$ O  H' B2 E4 \
6、 将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管，于4℃以30 000rpm离心30min。原有的细菌物生长得越密，应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。必要时，可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块，或抽入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒ＤＮＡ时，一般不会出现这样的问题。如果细菌碎片没能形成紧密的团块，可以以35 000rpm再度离心20min， 然后尽可能将上清转移到另一管内，弃去残存在管内的粘稠状液体。
9 K7 P" a2 r+ L5 ]7、 将上清转移到另一管内，纯化质粒ＤＮＡ。　0 l. t5 |* ]( ~1 O0 P4 _" h0 \
5 Y0 f6 d) Q6 b( ]  u% E
[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-9 09:46 编辑 ]

质粒大量提取之碱裂解法

% I$ C7 ~+ w7 G. H' C　　该法是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同时也是Brinboim和Ｄoly(1979)及Ｉsh-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如聚乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心等，一并联合使用。注：括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。
7 H7 z: P& Y# f8 u/ k7 n试验准备：& i% y/ X" [+ o1 ^2 N: ?; l
1、 溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖  25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)  10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。4 b# E( s) {* G& N) R+ L
2、 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％ＳＤＳ  盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。防止NaOH接触空气中的CO2所以要现用现配。! x- c& [$ b3 F4 g
3、 溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml  水 28.5ml。所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。: S8 X/ e4 |  B* M1 C
4、 溶菌酶溶液: 10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。
2 ^; y* H/ Z, X; v) Z6 z5 l试验步骤：. S3 |4 z+ k1 J
1、 将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物,重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。0 V( [. n5 l# {  U, |4 \+ K
2、 加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液。: U0 w' @% ^5 ^3 ]6 l: S' [) ~2 T6 Y
3、 加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
$ p1 p8 q0 Z, v- M6 s4、 加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上放置10min，会出现一白色絮状沉淀。沉淀应包括染色体ＤＮＡ、 高分子量ＲＮＡ和钾－ＳＤＳ－蛋白质－膜复合物。6 h2 M- a& O) n
5、 用ＳorvallＧＳ3转头（或与其相当的转头）于４℃以4000rpm离心15min，使转头自然停止转动。如果细菌碎片贴壁不紧，则可以5000rpm再度离心20min， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。, j% n6 u/ P6 ?" O1 g
6、 用４层干酪包布把上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。
! T% y% |* l1 e4 ?: H3 C- A7、 用Ｓorvall GS3转头（或与其相当的转头）于室温以500rpm离心15min，回收核酸。盐也会在４℃离心时沉淀下来。
1 s* S: b( V1 [8 b3 A8、 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70％乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。" Z+ j6 N( r, P2 T% [0 R8 Q
9、 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

质粒大量提取之 SDS裂解法

. c8 k: t0 @  O　　本法[根据Ｇodson和Ｖapnek(1973)的方法修订而成]的产量要低得多，但却比本章所述的其他方法更温和，是提取大质粒（大于15kb）的首选方法。: a$ R. B* N. O3 i3 c
试验步骤：
# Q# H6 s; l4 \/ z+ b$ j1、 将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管[橡树岭（Oak Ridge)型]中。
- h0 @$ F5 I$ i6 |" y( a0 T& b2、 加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时，溶菌酶不能有效地发挥作用。8 F+ B+ n1 I7 m  Y
3、 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液， 在冰上放置10min。
0 y: K* \( P0 u9 k! P4、 加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混匀内容物，使SDS均匀分散到整个细菌悬液中，操作应尽可能温和小心，以便最大限度地避免释放出来的ＤＮＡ受到剪切。/ w0 [" |; k, f  @
5、 立即加入6ml 5mol/L NaCl（终浓度为1mol/L）， 再次用玻棒温和彻底地混匀内容物，在冰上放置至少１h。- Y3 E) j7 Q3 c. B1 O) b5 V. s3 r0 q
6、 以4℃【用Beckman Ti50型转头（或与其相当的转头）】，30 000rpm离心30min，小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中，弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽，可用35 000rpm再离心20min，将上清转移到另一管中，去掉存在离心管内的粘稠状液体。5 f% X+ d7 e2 w# {
7、 上清分别用酚/氯仿和氯仿各抽提１次。! B( ^# q/ b* V7 d
8、 将水相转移到250ml的离心瓶中，于室温加入２倍体积的（约60ml ）乙醇，充分混匀，室温下放置1-2h。
' p' H# g& [2 q7 n5 J6 e9、 以４℃，5000rpm离心20min，回收核酸。# l0 B6 m9 s! ]# N: G
10、 离心管倒置于纸巾上，使最后残存的乙醇流干，在真空干燥内短时间干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。
! S% n; U) b  l' n1 g11、 用3mlTE(pH8.0)溶解ＤＮＡ。

质粒DNA纯化

7 V. A. s. U$ j试验原理：
2 w4 }8 t5 q" b7 g! J4 D, z3 g. u　　大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法，最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界， 使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开，因此， 纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。 然而， 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA，包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。( U9 v- ]1 w+ V& e$ c5 v0 n
氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA; V7 z* y3 J0 G" A8 p6 y
连续梯度：
, F2 p& D6 W# h5 s6 u+ F  Y) J1、 测量DNA溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。$ x: v8 D- W& R7 I- D( I
2、 每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表层）与DNA－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度大约７４０μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。
8 U! u* r& O7 M, A" q( b6 T  Y' F3、 室温下用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000rpm离心５min， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
; W" A) w: a5 _4、 用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
1 M# k1 ]/ J" t1 {. q5、 以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h（VTi65 转头）、 以45 000rpm离心48h（Ti50转头）、以60 000rpm离心24h（Ti65转头）或者以60 000rpm离心24h（Ti70.1转头）。普通光照下，在梯中心可见两条DNA区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）DNA和带切口的环状质粒DNA组成：下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭ＲＮＡ复合物，位于ＣsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个DNA区高产水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个DNA区带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使DNA达到平衡。' {" n' F. m# j7 K# k) M" P' C
6、 收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用１８号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将１８号皮下注身针头（其斜面向上）插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封住皮下注射针头的未端并将第２根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第３根皮下注射针头（18号），将下部的质粒ＤＮＡ区带收集到玻璃或塑料管中。+ Z# _4 u. y) O8 [( Z1 _5 d5 B
不连续梯度：2 L# s* q2 V" E3 y$ N7 K
　　该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中，这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到６h。% j* m! T8 h- Y2 @# o; }9 m
1、 将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。
3 s: q8 a: G5 J6 T" R2、 将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管（或与其相当的管）中，待用。8 h( c( V+ M. t" u: G
3、 如有必要，可酌情用TE(pH8.0)将质粒DNA溶液的体积精确地调到3ml。" Z0 _1 H3 M) ]+ K% ?5 Q. `
4、 在质粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解， 小心地混匀溶液直至盐溶解。
6 C6 l" w% K, i. x, I8 f# ^5、 称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量。# N' I' c- ]8 m6 [9 Q0 i2 P4 c
6、 加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散，此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。小心：溴化乙锭是一咱强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。】
: T+ \5 c& S4 ^% a4 S7、 室温下，用Sorvall SS34转头（或与之相当的转法）以8000rpm离心５min，浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙２锭和细菌蛋白所形成的复合物。9 W. V2 ]1 X' `' w, W- C3 |- {
8、 将22.86cm的巴期德吸管放入装有CsCl（步骤b制备）的离心管中， 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤g所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，使样本层位于CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情将步骤a中制备的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添满离心管，封口。' Y+ _# e6 z# ~" \9 a! }9 q
9、 将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头（或与之相当的转头中），于20℃以60 000rpm度离心６h。
9 N3 Z9 O* ?* l; l( ~6 {: T10、 回收闭环质粒ＤＮＡ区带。
8 w5 E( o: J0 W2 C4 u从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭5 B) m" b8 g! C+ a+ j2 M
　　溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。
% \) k; q& A: B有机溶剂抽提:' V6 l  {% ?) `* e" f
用后溶液应用下面的步骤进行净化处理。
4 G4 s9 @# e2 k9 \4 {' V: {3 F1、 将DNA溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和１－丁醇或异戊醇。
0 V) i( y& z& F) ~1 f2、 振荡混合两相。/ ~9 ~& Y  d* k1 J' s) s' [9 W. z. U
3、 用台式离心机,室温下以1500rpm，离心３min。: Q8 A1 Z' R+ V3 M/ t
4、 用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。
6 N$ [8 G! a) t% z. K7 r5、 反复抽提[步骤a－d]４－６次直到粉红色从水相和有机相中均消失。
+ N. o8 Y* l. O' E, O6、 用以下任意一种方法从DNA溶液中除去CsCl：通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析，对TE(pH8.0)透析24-48h，并换液数次或者用3倍体积水进行稀释并于４℃用2倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的6倍）沉淀15min，再以４℃，10 000rpm 离心15 min， 将沉淀的DNA溶于约1ml TE(pH8.0)中。如果将DNA的乙醇溶液置于-20℃，CsCl会沉淀。; R& _! M8 b5 v8 C  d
7、 测定DNA最终溶液的ＯＤ260值，计算DNA的浓度， 将DNA分成小份贮存于-20℃。如果制备的ＤＮＡ含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断），可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀DNA。
4 s! A# |4 Y( V, Z& m- ~. @溴化乙锭溶液的净化处理：　
  e6 A  U" p2 V　　溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。
0 Y" P7 w* T+ H8 @! t! B溴化乙锭浓溶液（即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理：
- |+ z, n2 o; O1 C9 \" r1 n; K0 o　　用沙门氏菌－微粒体测定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。
% Z9 o: U$ G5 ^; X1 O+ ]4 }; N' M1、 加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。$ Y6 f1 a4 E# p( v  d/ E
2、 加入0.2体积新配制的５％次磷酸和0.12体积新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠，混匀。【检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。】
: f* x2 e: Z: `4 m+ t3、 于室温温育24h后，加入大大过量的1mol/L碳酸氢钠。至此， 该溶液可予丢弃。
1 ]+ f% V( Y4 T6 K4 i' g1 i! ?溴化乙锭希溶液的净化处理) f8 D3 K0 T+ v/ I5 ~
方法一：, Z/ V" P) n5 B
1、 每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD－16，这是一种非离子型多聚吸附剂，可向Rohm和Haas 公司购置。4 _4 T5 Y: Y7 n4 g8 h; @* l
2、 于室温下放置12h ，不时摇动。* p! k- i' E$ c' }3 J  T2 h7 }
3、 用 Whatman 1号 滤�