免疫组织化学基本原理

1．简介
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化技术的优点
1．
特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2．
敏感性高　
在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3．
定位准确、
形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组织化学基本原理

1．简介
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化技术的优点
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<!--[endif]-->特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
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<!--[endif]-->敏感性高　
在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
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<!--[endif]-->定位准确、
形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组织化学基本原理

1．简介
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
免疫组化技术的优点
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<!--[endif]-->特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
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在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
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形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组织化学基本原理
1．简介
　　免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
　　免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
　　免疫组化技术的优点
1． 特异性强
　　免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2． 敏感性高　
　　在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3． 定位准确、
　　形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组织化学基本原理

1．简介
　　免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
　　免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
　　免疫组化技术的优点
1． 特异性强
　　免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2． 敏感性高　
　　在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3． 定位准确、
　　形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫组织化学基本原理
1．简介
　　免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
　　免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法。
免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。
　　免疫组化技术的优点
1． 特异性强
　　免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2． 敏感性高　
　　在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3． 定位准确、
　　形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。

质粒小量提取之煮沸法
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试验原理：
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煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中， DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度， DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。
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琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中
回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
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在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
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实验准备：
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1、 70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）
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2、 STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）
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3、 1.2M 氯化钠
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4、 TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）
/T,J6L-F:s#S8L????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨5、 STET:0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），5％Triton X－10（其他同碱裂解法）????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨%A'G.[$[+h
试验步骤：????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨#g3I4c,R7X8]8y4F3s:X
1、
无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上10000rpm离心1min，或者以????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨)a)}6]!]8j2?*A0L7Q6r)T ^
      4000rpm离心5－10min，弃上清液，倒扣于干净的吸水纸上吸干。7K2w%m%?7|7K*a
2、
将菌体沉淀悬浮于350μl STET缓冲溶液中, 涡旋使其混匀。
????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨6X2B:d6r!K#V5a B7F!E
3、
加入25μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制), 涡旋振荡大概3秒钟。8s"C4|%E-F:V/t4D&Y#E,j'r;V
4、
将eppendorf管放入沸水浴中,40秒后立即取出。
%]%l)N2c![*R0S2|#J9J
5、
微量离心机上以4℃，12000rmp离心10min。????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨#x.u'e#g8`8v+@
6、
用无菌牙签从eppendorf管中挑去细菌碎片。
www.genecool.com8V8k1I'@;Q4B Y9e!F+A5H
7、
在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置５min。
Z,W1x!V0w:e7H#W:Wâ?ѻ?ϭwww.genecool.com8、
微量离心机上以4℃，12 000rmp离心５min，回收核酸沉淀。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，www.genecool.com)T9o'm6Q$}-["e ^,u
以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。（可参考裂解法中的做法）。
!V"B$z7\ c.~9Y1v5a-|/A4Q8Gâ?ѻ?ϭwww.genecool.com9、
加入1ml７０％乙醇，以4℃，12 000rmp离心２min。轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，有时沉淀块
6^(Z)w9[-A C%?â?ѻ?ϭwww.genecool.com
贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止
&a8h/J5|4`*l-]$Vâ?ѻ?ϭwww.genecool.com
（大概需要２－５min）。????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨#F5V"[(O!^*n7n
10、
用50μl无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡即可，贮存于-20℃。www.genecool.com9t,{.o7s"B8[
注意事项：????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨6]9z6^+u$E7[&f
1、
大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨0Q$`*B7T%|9t!W8I:z1Z"{
2、
添加溶菌酶一定要有限度,浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同溶菌酶也能溶菌。基因酷
基因库www.genecool.com9c7J.U7K+I P.s9U
3、
提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。â?ѻ?ϭwww.genecool.com#H$Z,U-C-@!J
4、
试验步骤中的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。
/J6|,A8{/_+a8O5l??www.genecool.com5、
用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液一起倒掉。??www.genecool.com;H"F(W6t+S;B"N2m9m/X9W
6、
实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。
5K.s(P8Z7r7、
当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA时，建议不用煮沸法。因为煮??www.genecool.com(}9`*e$x;B6j9S#|
沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。
若要避免????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨3g"E)N#r9P f
这一问题可以在用70％乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。??www.genecool.com5h6?0H-A/J8u
8、
如果要通过限酶切割反应来分析DNA，可取１μlDNA溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl 10x限制????ɺίȋ?Ľ??ƽ̨"F4{#R,t/^"w(\;y6[
酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温度温育１－２h。将剩余的DNA贮存于－20℃。通过凝胶电泳分析经基因酷
基因库www.genecool.com.A4Z8L,V3Y(D+T1M/n
限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤中未能很好地去除www.genecool.com/z.w-y:Y+r.C0{
所有上清液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提DNA终产物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍过
(i3A-N9f5O2m5X??www.genecool.com      量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的
&|&]0M'[#d5e4i9Aâ?ѻ?ϭwww.genecool.com
困难。消化后，
加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2)和２倍体积乙醇沉淀DNA。

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