Western
免疫印迹

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
推荐书籍：《抗体技术实验指南》、Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）、《分子克隆》、《蛋白质技术手册》等。
原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western blotting试剂的准备
1.
30%储备胶溶液：        丙烯酰胺（Acr）

29.0g
亚甲双丙烯酰胺（Bis）

1.0g
混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2.
4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-Hcl
PH 8.8）
Tris
18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3.
4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl
PH 6. 8）
Tris
12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4.
10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5.
5×电泳缓冲液（PH 8.3）：
Tris

15.2g
甘氨酸

94g

ddH2O
定容到1000ml
SDS

5g
先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6.
10%过硫酸铵（AP）：0.1g
AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7.
2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液
0.5mol/L Tris-HCL (PH 6.8)
2ml
10%SDS
4 ml
β-巯基乙醇
1ml
甘油
2ml
1%溴芬蓝

1ml
置4℃避光保存
8.
TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用
9.
转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：   即1×SDS-PAGE
10.
0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：
NaCl


8.5g
(12H2O)Na2HPO4

2.9011g
(2H2O)NH2PO4


0.24g
加ddH2O定容至
1000ml
11.
封闭液；
1×PBS中加入


30ml
5%（V/V）脱脂奶粉


1.5g
0.02%叠氮钠



0.006g
0.05%Tween-20


0.015g
12.
漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液
每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20
13.
水饱和正丁醇：   正丁醇
50 ml
ddH2O

5 ml
加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
用时取上面一相加在凝胶上面。
14.
考马斯亮蓝染色法试剂：一般用R-250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）
染色液： 90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解R-250考马斯亮蓝（CBBR250）0.25g，用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）
脱色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液
15.
丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，
0.5%丽春红的水溶液
脱色液：TBS
16.
Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。
17.
PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。
18.
显色液：联苯胺显色液（DAB）
DAB
2ml
10%H2O2


60μl
PBS(0.1mol/L PH6.4)
10ml
19.
三去污裂解缓冲液
0.5mol/L Tris-HCL (PH 8.0)
0.785g/100ml
0.15mol/L
NaCl
0.8775 g/100ml
0.02%叠氮钠
0.02 g/100ml
0.1%SDS
0.1 g/100ml
100ug/ml苯甲基黄酰氟（PMSF）

1ug/ml Aprotinin

1%Nonidet P-40(NP-40)

1.0 g/100ml
0.5%去氧胆酸钠
0.5 g/100ml
表1
凝胶的制备

试剂        总量20 ml		分离胶浓度	（%）		浓缩胶 总量2.5 ml
	8	10	12	15
30%丙烯酰胺	4.0 ml	5.0 ml	6.0 ml	7.5ml	0.4 ml
1.5mol/LTris-Hcl PH 8.8	3.75ml	3.75ml	3.75ml	3.75ml	0.5mol/LTris-Hcl PH6.8 0.625ml
10%SDS	150μl	150μl	150μl	150μl	25μl
10%AP	150μl	150μl	150μl	150μl	8.3μl
ddH2O	6.9ml	5.9ml	4.9ml	3.4ml	1.44ml
TEMED	8μl	8μl	8μl	8μl	2.5μl

表2
SDS-PAGE凝胶的有效分离范围

丙烯酰胺浓度（%）	15	10	7.5	5.0
线性分离范围	12-43 kDa	16-68 kDa	36-94 kDa	57-212 kDa

样品处理
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。
注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。

质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

质粒提取原理

    质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
    在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。
   质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。生物资源共享|实验技术交流|生物人才交流|生物项目合作|生物创业1q"L1B$s7g.t)]9y$@7P
推荐书籍：《抗体技术实验指南》、Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）、《分子克隆》、《蛋白质技术手册》等。
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5|;X!Z(a#w6@&\ z与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。免费基因、免费质粒、免费菌株、生物科研、实验技术、生物人才交流、生物创业、生物融资、生物投资、生物风险投资、生物项目、生物基金、生物实验、生物软件、科研写作、生物考研、生物出国留学1@%J1g0y+]7A/p&r$w,N-p
Western blotting试剂的准备基因酷  功能基因、质粒载体、菌株等生物资源共享，生物科研、实验技术经验交流，生物就业、生物考研、生物出国留学经验交流，校园生物联盟、生物人才交流，生物创业、生物项目交流合作的网络平台。2O)j5q-F1T3}8_'}
1.基因酷  功能基因、质粒载体、菌株等生物资源共享，生物科研、实验技术经验交流，生物就业、生物考研、生物出国留学经验交流，校园生物联盟、生物人才交流，生物创业、生物项目交流合作的网络平台。)x5c7Z;o&?;O8k:[

质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。