我遇到这方面的麻烦了，希望这对酷友有帮助！

Hind III 
                    
C AAGCTT G 
CC AAGCTT GG 
CCC AAGCTT GGG

加两个保护碱基20h酶切，切割率居然为0~~~~~~~


完蛋了，我的上游引物HindIII酶切位点上游只加了两个保护碱基，有救吗？？？？？
用TAQ酶的扩增会在3’端加A，这样能不能提高后续的酶切？？？不知道多了个A的黏末端有没有效！

保护碱基的确很有讲究，有的时候不对，怎么切都切不动，谢谢angelblue9 分享。

是不是保护碱基数够了就行？至于加什么样的碱基应该没事吧！发觉越来越敏感了！

是不是哦，我以前感觉如同楼上的所言，但是最近有个产物老是切不下来，让我郁闷的很

这是我帮别人做的，引物设计好了。 他以前做的步骤是，将目的基因连接到T载体上，在T载体上切割，然后才连到另一个表达载体上。 而我想省了T载体这一步，想一步到位，结果小问题给忽视了！

To:angelblue9 上游引物HindIII酶切位点上游只加了两个保护碱基，有救吗？ 回答：有救，不过你只能先连接到T载体上，测序后，再从T载体上切就可以了。 用TAQ酶的扩增会在3’端加A，这样能不能提高后续的酶切？？？不知道多了个A的黏末端有没有效！ 回答：对提高酶切效果不是很大。

谢谢您了！

我的引物是别人帮忙合成的，他的流程是把它连接到T载体，而我不做这一步，因为我们实验没有T载体，呵呵，最主要比较麻烦，想一步到部。

可是引物问题给忽视了，因为刚入行，有很多细节压根不知道，总是为之付出代价后才惊醒！

怎么Sal I 加保护碱基后，酶切效率还那么低，不是可以不加保护碱基吗？http://www.zsr.cc/ExpertHome/StudyDatum/200701/75876.html

谢谢您的分享！这对分子生物学方面真是太有用了！