有做过酶切经验的朋友帮忙看看我下面的双酶切体系是否合理:
我已经把一个片段连接到pGMT载体上，我现在需要用SalI和PstI进行分别对载体和PCR扩增的产物分别进行双酶切试验，插入第二个片段，我设计的如下的酶切过程：
现用SalI酶切，再用PstI酶切，采用分布酶切的方法。
SalI酶切体系如下:
SalI                  1ul
10×Hbuffer        2ul
DNA                  <1ug
双蒸水            20ul
酶切5个小时候，在65度水浴锅中加热20分钟，使得SalI酶失活。
因为PstI酶的缓冲液和SalI酶相同，我是否不需要补加缓冲液，然后直接加入PstI酶1ul进行酶切？也是酶切5个小时。
然后跑电泳，胶回收酶切产物后，进行片段连接。
注;我的PCR产物是加入了酶切位点和两个保护碱基。
请有经验的朋友帮我看看，我的载体和PCR扩增产物是否都可以按照这个系统进行酶切？如果有问题，请大家多给我提意见。
我忘记说了，我的两个酶切位点在PGMT载体靠的很近，少于3个碱基，我是想在载体构建发夹结构，所以需要连接两个片段，组成反向重复序列。

我最近一直在做载体构件的实验,在这里发表一点意见,不知道对不对?
您用的是Sal-1/Pst-1 的双酶切，两个酶的公用酶切体系是１ＸＨ，在Ｈ的universal buffer的相对活性这两个酶都是１００％，所以你不用分次切，可以直接用双酶切．给你设计一下体系，你看是否合适
　１０ＸＨ Buffer        2ul
    Sal-1                           1ul
     Pstl-1                         1ul
     质粒　　　　　　    3 ul
      双蒸水　　　　　   13ul
总体系是２０微升不是水２０

切两小时，你跑琼脂糖凝胶电泳，看看有没有目的片段，
两外我看不明白，你想怎么构建自己的载体？
要不说清楚一点？

首先谢谢上面的朋友，我考虑到用上面的方法，但是我的两个酶切位点靠的很近，所以我需要分开酶切，如果两个酶同时酶切，根本就切不开。

    请问楼主 为什么要一个一个切的啊，如果像你所说缓冲液是一样的，那么你完全可以在一个体系里面进行的啊，这样又方便也不会引发其他情况发生。你就同时利用两个酶对载体和PCR产物进行双切后同时跑胶回收，没有什么问题哈，最近两周天天都做这些的啊

谢谢楼主，因为我的两个酶切位点在载体上的排列顺利是紧密靠着的，中间没有碱基序列隔开，所以我担心我两个酶同时进行切割，切不开。我还没有开始做试验，如果可以同时切割，我先试验一下。

建议一个一个切,很敢时间吗? 有在论坛问的时候都已经切出来了,呵呵