一个关于Gst纯化蛋白的问题：请各位大侠帮助
我用pGex系列的质粒构建一个纯化蛋白的片断（350aa, MW 38KD; 加上GST片断：大约64KD ），转化到BL21（DE3）进行表达
开始摸温度和IPTG的浓度，观察表达情况
37度，摇到OD600=0.6时加IPTG 终浓度0.5mM, 继续37度 3-4小时摇菌。 对照用相同的转化细菌同时处理，但是不加IPTG。
分别取3ml上述两菌液，离心沉淀，加入50ul loading buffer （主要含有 2% SDS； 20% glycerol; phenolbrom blue）裂解, 水中煮沸5 min，上样SDS-PAGE跑胶，然后染色脱色.
结果发现,如下问题：
在40KD左右有明显的诱导条带，但是在60KD左右基本没有明显的诱导条带。
我分析了一下问题，望请教：
1． 基本原因可能是表达的蛋白中止，不知有何方法解决
2． 长片断未能出来，可能会因为检测的菌液少吗，兄台们摸条件时，都用什么条件，用多少菌液检测就够了？？？
3． 应该不是包涵体的原因吧，毕竟裂解液都应该打破了，把蛋白释放出来了吧？ 应该和所用的温度与时间没关系吧，毕竟这两个因素主要影响包涵体的形成吧？ 而且3-4小时在37度应该足够了吧？
4． 我进一步 要做GST pulldown，用很纯的蛋白吗？有部分不完全的片断没关系吧？？？但是，全长的蛋白比例不能太小吧，以至于检测不出呀！！
5． 问一个相关的，以后做GST pulldown，蛋白的活性很重要吗（毕竟不是检测酶的活性呀）？？？另外，如果从包涵体中释放的蛋白也应该能检测到蛋白之间的相互作用吧？？ （比如用sarcosyl裂解包涵体得到的蛋白）
6． 另外，看了网上别的兄弟大作，大肠杆菌中用的密码子和人类的不同，有的使用频率很低，不知道这是否影响蛋白的完整性。不知道那里能查到具体的细菌的常用密码子表？能否列一下，两者之间的差异？而且遇到这种情况又如何处理。
7． 搜索了一下，mRNA的二级结构也影响质粒的表达完整性，但是用什么软件能，能否推荐一下？？
8． 遇到上面的问题，兄台们都是如何处理，需要换质粒，细菌或是插入片断吗？
潜水一段时间，发现这里的版主和管理员，是个大牛，希望多多指教
