[实验原理]
磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物

[仪器、材料和试剂]
1　呈指数生长的真核细胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞）
2　完全培养液（依所用的细胞系而定）
3　CsCl纯化的质粒DNA （10～50μg/次转染，二次纯化）
4　2×HEPES缓冲盐水(HeBS)
(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH调pH至6.95～7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。
5　2.5mol/L CaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。
6　磷酸缓冲盐水（PBS）
7　37℃，5%CO2的加湿培养箱
8　100mm组织培养平板
9　15ml锥形管

[方法与步骤]
1　传代细胞准备　细胞在转染前24ｈ传代,待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培养液培养细胞。
2　DNA沉淀液的准备　首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于μL无菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
4 室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。
5 将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中，轻轻晃动。
6 在标准生长条件下培养细胞4～16h。除去培养液，用5ml　1×HeBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。
7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。

      这两天很忙多以没有很多时间上来大家见谅哈，如果明天有时间我一定上来跟发专帖哈！关于脂质体的转染以及电穿孔转染哈！

转化所需的质粒要无菌么？？ 一般提取时都不会是无菌条件的吧

脂质体能携带蛋白或者多肽进入淋巴细胞么

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
此实验步骤设计用来进行60-mm平板中贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。
1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每板细胞，使用500μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释8μg DNA。多板操作可以批量制备。
3. 对于每板细胞，使用500μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释20μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
5. 直接将复合物加入到每板中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为5ml无血清培养基。
6. 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析。

引用:

原帖由 野百合的春天 于 07-8-2 00:06 发表
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
此实验步骤设计用来进行60-mm平板中贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。
1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细 ...

学习了,谢谢楼主哈!