各位大侠,我在用常规RT-PCR扩做单股负链RNA病毒的一个2.6Kb的片段时,不知咱的,怎么也扩不出来,听说用搭桥PCR可以扩长片段基因,请大家把这种技术教教我.谢了!!

   好像你理解错了吧，搭桥PCR又称： PCR片段拼接的方法，即SOE法（splicing by over-lapping extension）是指：若是只有两个片断，步骤就像普通PCR一样的，只是体系中没有模板。将两个片断作为引物加入即可。若是有多个片断需要搭桥，第一轮pcr先两两扩增，然后将第一轮的产物直接取1ul作为模板,再加入5‘和3‘引物扩增第二轮，以此类推。
      或者这么说，设计4条引物，其中按顺序引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引 物序列；同样c左半段为基因I的引 物序列；b和c的部分碱基可互补配对。基因I、Ⅱ分别扩增，两种产物混合，经变性及退火处理，两链部分碱基互补配对，成杂交链。
      搭桥PCR其实就是一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA的方法，是很容易得到目的条带的。
      换句话说，搭桥PCR实际上就是设计了搭桥引物，其实就是一种利用搭桥引物的PCR罢了，所以说引物设计还是关键啊

谢谢binbintt

您好！
我也在做搭桥PCR，可不知为什么，两段序列总是连不到一起去，跑电泳是一片空白。请您帮忙分析一下。不胜感谢！
序列1是1300bp, 序列2是350bp，重叠序列是21个，pcr反应体系是25ul：
水18ul,
10*buffer2.5ul,  
dNTP2.0ul,  
上游和下游引物各0.5ul,  
序列1和序列2各0.5ul,
pfu高保真酶0.5ul.
pcr反应条件是：
94C,3m;
94C,30S; 50C,1m; 72C,2m. 25个循环
72C,10m
另外，两段序列在融合之前都未做回收纯化处理，不知这点对融合有没有影响。还是我的反应体系或者反应条件有问题？
感谢您的关注！