我的基因开放阅读框已经得到，要进行整个基因的原核表达实验。我根据开放阅读框的酶切及表达载体分析，确定了两种内切酶，Ecor I和Not I，在起始密码字和终止密码子附近设计了酶切引物，但是PCR的时候只出来引物二聚体，没有目的条带。模板和酶确保没问题。将酶切引物在primer上检测，效率很低几乎全是红。但是引物只能这么设计了，各位大侠，我通过什么办法可以得到我要的目的片段呢？急！！！！恳切希望得到指导，谢谢了。

郁闷中人酷友： 您好！引物效率低，几乎全时红，可能是引物设计的不好了， 在没有其他办法的情况下，不妨试试以第一轮的PCR产物为模板再括一下第二轮，也许第一轮产物太少，跑胶看不到；再扩一轮没准就出来了，呵呵，我经常使用这种方法。

当引物差的时候扩增效率很低的情况下，可以试一试touch downPCR ，可以有效地提高扩增效率，增加引物扩增特异性！

将你的引物长度延长至40nt左右，效果可能会好一些。

谢谢大家啊，我按你们的方法去试试，这里真好。

    建议楼主如果试验成功可以回帖描述成功经验与大家分享哦

不好意思啊，最近实验忙，都没上来了。我把上述大家提供的建议综合了一下，即第一轮做了个touch down，以第一轮产物为模板，二次PCR时选择了较高的退火温度，出来结果了。测序也是我要的片段。谢谢大家!

   恭喜恭喜！

恭喜！