免疫共沉淀技术路线
准备工作：
预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）
4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）
13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）
15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）
EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200mM的储存液，室温保存）
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
NP-40: 1%
去氧胆酸钠：0.25%
NaCl: 150 mM
EDTA: 1 mM
PMSF: 1 mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml
Na3VO4: 1 mM
NaF: 1 mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
from towersimper
Anti-FLAG Co-immunoprecipitation
Transient transfection:
Day 1 (preferably early):
Trypsinize a confluent 10-cm plate of cells and plate 0.5 ml cells plus 1.5 ml medum per 3.5-cm plate (for multiple plates, mix cells after trypsinizing and plate from the mixture to get more homogenous plates).
Day 2:
When plates are 50-80% confluent transfect the cells using Lipofectamine as described by manufacturer.
For each 3.5-cm plates use:
8 µl Lipofectamine; mix with 100 µl O-MEM
1-2 µg plasmid; mix with 100 µl O-MEM
Mix Lipofectamine and plasmid mixtures.
Leave at RT 15-45 min.
Add 800 µl O-MEM.
Remove medium from cells
Wash carefully with 1 ml O-MEM.
Add Lipofectamine/plasmid mixture (1 ml total) to cells.
Incubate 5-24 hours in incubator
Remove transfection mixture.
Add DMEM/10% FBS carefully.
Incubate 24-48 h.
Immunoprecipitation:
Day 4:
Wash cells carefully with 2 ml PBS.
Add 1 ml PBS and scrape off cells using a rubber policeman.
Transfer to eppendorf tube.
Spin 1,000 rpm, 10 min (not faster!).
Remove PBS.
Resuspend in ice-cold 400 µl hypotonic gentle lysis buffer and transfer to eppendorf tube.
Incubate on ice, 10 min.
Add NaCl to 150 mM. Incubate on ice 5 min.
Spin 14,000 rpm, 4C, 15 min.
Transfer 50 µl supernatant to 50 µl of SDS LB (Total extract control). Store at -20C.
Transfer remainder of supernatant to tube containing 40 µl anti-FLAG-M2 agarose slurry, which has already been washed twice with 1 ml NET-2 (1,000 rpm, 1 min for each wash).
Nutate at 4C, ≥4h.
Wash beads 8 times with 1 ml NET-2 (ice-cold). Spin 1,000 rpm, 1 min for each wash. (Try to remove as much wash buffer as possible without removing beads in each wash).
After last wash, remove all wash buffer with pipette. Add 20 µl SDS LB to beads (pellets).
Western blot:
Run SDS gel.
Cut four pieces of 3MM papers and a piece of nitrocellulose membrane at 8x11 cm (or 15x20cm for large gel).
Prepare 1 liter (or 4 liters for large gel) of transfer buffer: 20% methanol,3.1 g/l Trizma base, 14.4 g/l Glycine. Pre-cool in cold room.
Transfer gel to a piece of 3MM and place on top of a piece of 3MM under transfer buffer. Place membrane on top of gel followed by two pieces of 3MM. Remove bubbles by rolling a pippette over the "sanwich".
Transfer to transfer box and fill with transfer buffer.
Run at 80V, 3-4 hours in cold room.
(Optional: Check membrane with Ponceau Red. Wash with Blot buffer)
Transfer membrane to Blot buffer/10% milk.
4C, o/n.
Incubate at RT 1-4 h with primary antibody in Blot buffer/5% milk.
Wash 2x5 min with Blot buffer.
Incubate at RT 1-4 h with secondary antibody in Blot buffer/5%milk.
Wash 3x10 min with blot buffer.
Drip off, but don't dry out.
In dark room:
Incubate with chemiluminescence reagent 1 min.
Drip off, but don't dry out!!
Wrap in Saram Wrap. Use autorad tape (or other means to orient film)
Expose to film 1 min.
Develop, and evaluate for longer or shorter exposure.
(Signal has a hal-life of 5-10 mins.)
Stripping:
Incubate in water 15 min.
Incubate in 0.1M NaOH, 15 min.
Incubate in water 15 min.
Block in Blot buffer/10% milk, 4C, o/n.
Buffers:
Hypotonic gentle lysis buffer:
10 mM Tris-HCl pH 7.5
10 mM NaCl
10 mM EDTA
0.5% Triton-X100
1 mM PMSF
1 µM aprotinin
1 µM leupeptin
