基因表达及其调控
基因表达(gene expression)：储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。实质上是指基因通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程。
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| 中心法则： |  |
我们已经知道分化的体细胞中携带着生物体细胞生长发育的全部遗传信息，而在分化的细胞中只表达了它整个遗传信息的一部分（10%），而且不同类型的细胞只表达全部遗传信息的不同部分。这就很自然地产生一个问题，基因型相同的细胞，为什么分化出不同的细胞和器官呢？由于体细胞的全能性，我们知道，这并不意味着细胞的分化是基因的丢失、突变或永久性地失去活性，而是通过基因表达的调控来实现的。 各类细胞中均有相同的一些基因在表达，说明这些基因的功能对于每个细胞都是必须的，这些基因称为看家基因（house keeping）。在哺乳动物中约有10,000个house keeping。另外不同细胞类型存在特定基因表达(在一个组织中为丰富的mRNA，在另一个组织中就可能成为稀少mRNA而存在或不存在),这些基因称为奢侈基因（luxury gene），有人估计奢侈基因数目可能超过看家基因数目。
第一节 大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控
一、大肠杆菌乳糖操纵子模型
1、操纵子（operon)：很多功能上相关的结构基因串联排列在染色体上，由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。
2、操纵子的组成：
----结构基因(structural gene, SG) ：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因
----启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
----操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。
二、正调控和负调控
1、负调控（negative control）：
无调节蛋白时，基因是表达的，加入调节蛋白，基因活性被关闭。任何干扰基因表达的作用都是负调控。
调节蛋白---阻遏蛋白（阻遏物）;
特点：一个阻遏蛋白或与DNA结合，阻止RNA聚合酶启动转录，或与mRNA结合阻止核糖体的启动与翻译。
2、正调控（positive control）：
无调节蛋白时，基因是关闭的，加入调节蛋白，基因活性被开启。
调节蛋白---无辅基诱导蛋白（apoinducer）。
不论是正调控还是负调控，操纵子还可以通过调节蛋白与小分子物质的相互作用而达到诱导状态或阻遏状态。根据对能调节操纵子表达的这种小分子的应答的性质，又可以把操纵子分为两大类：
3、可诱导的操纵子（inducible）
在可诱导系统中，产生诱导作用的小分子称为诱导物(inducer)；当诱导物活化了无辅基诱导蛋白或是钝化了阻遏蛋白，操纵子便处于可诱导状态；
4、可阻遏的操纵子（repressible）
在可阻遏系统中，产生阻遏作用的小分子物质则叫做辅阻遏物(corepressor)。若是辅阻遏物钝化了无捕基诱导蛋白或是活化了无活性的阻遏蛋白，那么操纵子就会转入被阻遏的状态。
在遗传学上利用调节蛋白基因的突变(产生无功能的蛋白)所产生的后果来区分正、负调控系统。无辅基诱导蛋白失活导致不可诱导状态或超阻遏状态(指可阻遏操纵子变成不能阻遏的状态)，是正调控系统的特征；而阻遏蛋白失活产生的组成型(constitutive)表达则是负调控系统的特征。
三、大肠杆菌乳糖操纵子的负调控
诱导物和诱导酶的概念
1、非底物诱导物（gratuitous inducer）
既能诱导酶的产生而本身又不被分解
2、大肠杆菌乳糖代谢的各种突变型
结构基因的突变 ：
lac Z+ → lac Z－； lac Y+ → lac Y－； lac A+→ lac A－
组成型突变体（constitutive mutant） ：
在没有诱导物的条件下lac ZYA都能表达
突变位点集中在 lacO 和 i 这两个基因位点上。
F’因子－－形成部分二倍体
3、操作基因组成型突变OC……顺式显性
O＋ → Oc 阻遏物不能结合
4、阻遏物结构基因 i 突变
(1) Lac i－突变体：形成不正常的阻遏物．它不能结合到操纵基因上。
但当形成i＋／i－Z＋部分二倍体，细胞为诱导型时．即i＋产生正常阻遏物，可以关闭Lac0，而一旦加入诱导物，由于诱导物与阻遏物结合，使后者失去结合操纵基因的功能．结构基因得以转录。由此可见如Lac i＋对如Lac i－为显性，而Lac i基因是一个控制因子，其作用无顺反位置效应，它是作为一种可以在细胞内扩散的组分来实现控制作用的。
(2) Lac iS突变体
对i基因其他突变体的分析还说明这些突变实际上是影响到基因产物阻遏蛋白的结构状况。通过使lac i失活的突变，已经确定在阻遏物亚基上有两个结合位点：一个是识别操纵基因序列的DNA结合位点；另一个是与小分子诱导物相结合的诱导物结合位点。如菌株发生lac iS突变时，其iS基因产物阻遏蛋白由于构型改变，不能结合诱导物。因此，不论细胞内是否存在诱导物，阻遏物都不再被诱导而始终结合在操纵基因上，以致突变株丧失了合成酶系统的全部能力。这样的突变体又称为超阻遏突变体(super repression mutation)。即使让lac iS与lac i－菌株形成部分杂合子(iS/ i－)，也不会改变iC不能转录的遗传效应。而iS不仅对i－为显性，且对野生型(i＋)也是显性。
结论：阻遏物亚基上的两个结合位点
（1）与操作基因的结合位点
（2）与诱导物的结合位点
5、启动区P突变(P＋→P－)
RNA聚合酶没有结合位点，于是操纵子中所有的酶都不能合成，由此导致超阻遏型。
对影响启动子功能的突变体的研究分析，在-35区的下降突变是降低了闭合复合物的形成速率，但不抑制开放复合物的转换，而-10区内的下降突变虽不减缓闭合复合物的起始形成，但却使其转换成为启动状态延迟。由此可见—35序列的功能是为RNA聚合酶提供识别信号，而-10区序列则是使起始复合物由关闭状态转变成启动状态。
在Pribnow框与Sextama框之间，其序列的核苷酸成分并不十分重要，因为其中核苷酸发生替换对转录效率无明显影响。但是这两个共有序列之间的距离却至关重要。实验证明当两者之间距离为17bp时转录效率最高。天然启动子中这一段距离大多是15—20 bp。
6、总结
四、大肠杆菌乳糖操纵子的正调控
1、现象：
当E．coli以乳糖为唯一碳源时，lac操纵子可被乳糖诱导而表达,可是各培养基中同时加入葡萄糖时，细菌优先利用葡萄糖，只有录葡糖耗尽时，乳糖才能作为诱导物。这种现象称为分解物阻遏(catabolite repression)
当培养基中含有葡萄糖时就会阻止这些操纵子的功能，因此这些操纵子也称为葡萄糖敏感操纵子。
2、实验：
(1)cAMP（环化腺苷一磷酸，cyclic AMP）
1965年，B Magasonik发现在大肠杆菌中也含有cAMP，而且菌株内cAMP的含量常随细胞的生理状态发生变化，即当细胞处于碳源饥饿条件下，cAMP水平显著提高，反之．在细胞生长的培养基中含有大量葡萄糖时，cAMP水平明显降低；乳糖操纵子也有类似的情况，只有当以乳糖为唯一碳源时，β—半乳糖苷酶的合成才增加。但是在以乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP，β—半乳糖苷酶的合成速率也会大大提高，可达到只用乳糖为碳源时的水平。这说明，菌株内，cAMP的浓度能影响到β—半乳糖苷酶的合成速率。
进一步的分析发现，这一过程还与一种诱导蛋白有关。
（2）cAMP-CAP复合体
分解物基因激活蛋白(catobolite gene activation protein，CAP)
cAMP受体蛋白(cAMP receptor protiein．CRP)
这是一种二聚体蛋白质，每个亚基含209个氨基酸残基，可起转录起始因子的作用，在有cAMP时，能使操纵子有效地进行转录。
(i) cya基因和crp基因的互补作用：
CAP单独存在时无活性，但它可被cAMP激活；cAMP腺苷酸环化酶基因突变（cya基因），酶无活性，cAMP不能合成；编码CAP蛋白的基因（crp基因）的突变，使CAP失活，都影响乳糖的利用，lac操纵子在没有葡萄糖时也不能表达。
结论：cAMP和CAP都是lac操纵子转录所必须的；二者结合成复合物，可同启动子结合。（体外的互补实验证实了crp +细胞的作用并分离出一个激活蛋白CAP）
(ii) CAP结合位点的结构：
一些物理化学的研究表明，CAP结构变化与cAMP的结合有关。采用保护降解法的分析，可知在lacc P区上游-72~-52核昔酸对处有一个CAP结合位点，但只有在有cAMP时，CAP才能结合于此位点。CAP结合位点中有一段对称反向重复序列：这一序列的第3位和倒数第3位的G／C对之一突变成A／T对后，也影响cAMP-CAP与它的结合，而成为启动子下降突变。
(3)lac操纵子的正调控机制
cAMP-CAP复合物与DNA结合改变了这一区段DNA次级结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链。可能是cAMP-cAP先通过与RNA聚合酶结合，再与DNA结合，因而促进了RNA聚合酶与启动子的结合，从而增强了转录。
cAMP-CAP复合物的形成取决于细胞内cAMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，细胞内cAMP浓度降低，形不成CAP-cAMP复合物，因而乳糖结构基因不被转录。
