刚开始进入实验室,好多东东不太懂,各位师兄师姐帮帮忙.我打算克隆一个基因,然后构建真核表达载体转入细胞中进行超表达,研究其功能,所以请问各位我是要设计这一基因的引物该如何设计,是设计它的全长cDNA引物还是ORF引物?
另外,这个基因在我要做的物种(猪)中还是未知,有人也告诉我说找EST,可是竟然没有,所以引物设计就有一定难度,头大了.

[quote user="NO18"]

刚开始进入实验室,好多东东不太懂,各位师兄师姐帮帮忙.我打算克隆一个基因,然后构建真核表达载体转入细胞中进行超表达,研究其功能,所以请问各位我是要设计这一基因的引物该如何设计,是设计它的全长cDNA引物还是ORF引物?
另外,这个基因在我要做的物种(猪)中还是未知,有人也告诉我说找EST,可是竟然没有,所以引物设计就有一定难度,头大了.

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是用ORF引物,物种(猪)中还是未知,可以借鉴其它相近物种,但有风险.

麻烦再问一下kaige88 ,如果设计ORF引物,是否就在起始密码子和终止密码子处设计?该如何设计?

我也想知道这个答案！有哪位知道，赶紧回复啊！万分感谢！

   当年我也是扩增一个猪的未知基因，看来遇到战友了哦！！呵呵！
   对于未知基因的扩增，特别是像猪这种与人有极强相似的物种来说还是比较容易的，当然这个容易是指至少你有个可以比对的参照物。人的基因是全部已知的，所以只要你把你的大区域（未知基因）或者你要扩增的该段基因在人上的名称在NCBI上面BLAST一下，先看看那些物种有该基因或者已经报道了该基因，并且观察该基因的保守区域大致位于那段，等等详细信息你需要了解。
     之后你可以先设计一段引物用来扩增CDS区域也就是你说的ORF引物，等你把这段基因拿到手之后，可以利用RACE方法来拉整个cDNA序列。
    猪的EST应该有，我觉得你可能没有找到，猪的gene map就要出来了，北欧那边早在05年就已经完成了EST序列的测定，如果不是谣传的话应该可以找到的。
    至于引物设计，论坛里面有很多，
    楼主可以参考一下帖子：

【分享】Primer Premier使用手册中文版－－教你如何使用软件设计引物 
                           www.genecool.com/bbs/21684/ShowPost.aspx
【原创】oligo使用图解 
                           www.genecool.com/bbs/26867/ShowPost.aspx 
     祝你实验顺利！