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超滤/DEAE离子交换层析法分离纯化IgY的研究 

方希修1.2，管军军2 ，乐国伟1*，周新民3，施用晖1  
（1.江南大学食品学院食品营养与安全研究所、江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214036;2.江苏畜牧兽医职业技术学院营养与生物技术研究室，泰州，225300；2.河南工业大学生物工程学院，郑州，450052；3.江苏省家禽科学研究所，扬州，225003；） 
摘要：应用平板式膜超滤技术与DEAE离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分离纯化。首先，卵黄液经过缓冲液稀释分离；然后，用平板式膜组件对其超滤，并且分析了各种因素对其的影响，确定分子截留量为100kDa，操作压力差为0.12MPa、进料温度为30℃，pH5.2，截留液抗体回收率达到91.89％，纯度为86％；最后，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY. 
关键词：卵黄免疫球蛋白(IgY)；超滤；平板式膜；DEAE离子交换层析 
 
Separation and Purification of IgY by Ultrafiltration/DEAE Ion- Exchange Chromatogram 
Fang Xi-xiu1。2 Guan Jun-jun3 Le Guo-wei1* Zhou Xin-min1 Shi Yong-hui1  
(1.Food Nutrition and safety Institute ,Food Science and Technology ,Southern Yangtze university, Wuxi, Key Laboratory of Industry's Biotechnology of Southern Yangtze university of Education Ministry，China, 214036；2. Nutrition and Biotechnology Research Laboratory of Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College ,Taizhou China, 225300；3. Henan University of Technology, Zhengzhou, 450052) 
 
Abstract: IgY(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY) of egg yolk was separated and purified by technology of plate-type membrane ultrafilteration and DEAE ion-exchange chromatogram. Firstly, the egg yolk liquor was pretreated by dilution separation, and then IgY was separated by ultrafilteration using plate-type membrane module. Moreover, we researched many factors affecting ultrafilteration, and optimality was achieved at 0.12MPa, 30℃, pH5.2 with 100kDa(MWCO). In this condition, about 91.89% antibody was recovered, and its purity reached 86%. Finally, the purity of antibody was enhanced by DEAE ion-exchange chromatogram. 
Key words: IgY of egg yolk; Ultrafileration; Plate-type membrane; DEAE ion-exchange chromatogram. 
 
 
0 前言 
卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY )。母鸡接受免疫后，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG择性地转移到卵黄中形成IgY。IgY是一种7S免疫球蛋白，分子量180 kDa，由两条重链(分子量67～70 kDa)和两条轻链(分子量22～30 kDa)组成，等电点接近5.2。已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，与其他用于被动治疗的免疫球蛋白相比，IgY具有价廉易得、稳定性好、可口服等优点，在疾病的免疫检测和防治方面具有良好的应用前景[1]。Burfey等报道在蛋黄水溶性部分（WSF）主要包括分子量70kDa和42kDa的α-和β-低密度脂蛋白。经预处理后的WSF，在盐沉淀回收大部分lgY后，选用膜的截留分子量100kDa，经超滤法分离可得到高纯lgY，能明显地改善超滤的分离效果，将杂质与lgY分离，提高分离效率。但是，在相同情况下，直接用超滤法分离，无法提取出高纯lgY。本文利用膜超滤技术与DEAE离子交换层析法分离提纯IgY，并对超滤的操作条件进行了优化。 
 
1 材料和方法 
1.1 试验材料与装置 
平板式膜材料：聚丙烯腈(PAN)、醋酸纤维(CA)，MWCO均为6万，北京工业大学环境与能源学院膜分离技术中心和中科院生态环境研究中心。膜截留分子量的选择由于超滤目标截留物分子量为180kDa，故选用MWCO为150kDa、100kDa和50kDa的膜，平板式超滤器作为卵黄水溶液的预处理，再用DEA E离子交换层析分离。毛细管电泳仪。 
1.2 分析方法 
采用考马斯亮蓝法[2]测定蛋白质的含量，蛋白质浓度测定采用Lowry法。 
1.3抗体的提取分离 
卵黄液用0.05mo1/L，pH5.2的乙酸－乙酸钠缓冲液1:9倍稀释[3]，搅拌15min，4℃，静置10小时，冷冻离心（4℃，10000g，25min），取上清液，即取水溶性成分（WSF）。提取液中蛋白质分子量在3.6kDa-338kDa，提取液陶瓷膜超滤，超滤液经DEAE离子交换层析分离。 
1.4 计算方法 
超滤通量（JV）的测定方法：用量筒在一定时间内收集一定体积的滤液，以单位时间内通过单位膜面积的液体体积表示渗透通量。 
溶液通量JV(L/m2•h)=V/(S×t) (1) 
式(1)中：V－滤出溶液体积，L；S－膜面积，m2；t－过滤时间，h.； 
蛋白质去除率R：R=(1－滤液中蛋白质含量原料液中蛋白质含量)×100% (2) 
膜污染率FR：FR=J0～JWJ0 (3) 
式(3)中：J0膜使用前纯水滤出速率，L/m2.h；JW膜使用后纯水滤出速率，L/m2.h. 
1.5 DEAE离子交换层析柱纯化抗体与毛细管电泳纯度检定  
DEAE离子交换层析纯化抗体：经过超滤的浓缩样品用DEAE 阴离子层析柱纯化, pH7.2 PBS平衡并洗脱,收集蛋白峰。 
毛细管电泳条件：电压30KV，时间25min，缓冲液Tris-HCl,0.05M，pH8.0，压力进样，压力为0.5psi，214nm吸收。样品浓度1mg/mL. 
1.6 实验设计 
根据单因素实验的基础上，对主要影响超滤的4种主要因素进行全因子试验设计，即为4因子2水平的24设计，再加上中心点的四次重复试验，共20次计试验。实验结果用SAS(V9.1)进行数据分析。 
2实验结果 
2.1操作条件对膜通量的影响 
2.1.1进料温度 
操作温度为10、20、30、40、50℃，操作压力为0.12MPa，膜通量为超滤后5分钟的平均值。选用的浓缩比为3。 
 
图1 进料温度与膜通量的关系 
 
由图1可以看出，随着操作温度的上升，膜通量呈上升趋势。原因在于随温度的增加，料液的粘度降低，传质系数提高，有利于减轻浓差极化，提高渗透通量。至30℃以后逐渐减缓，30℃以上料液中某些蛋白质变性，使之结构变得松散，堵塞膜孔，膜通量增加减缓。并且在30℃以上容易滋生微生物，抗体也易失活。因此在30℃以下进行超滤应是最佳选择。 
2.1.2超滤时间 
压差0.12MPa，温度15℃，每隔20分钟测定膜通量。 
 
图2 超滤时间与膜通量的关系 
 
由图2可以看出，在最初的40min内，透液通量下降很快，主要是料液中的悬浮颗粒沉积在膜面形成凝胶极化层、部分小颗粒堵塞膜孔，一些大分了吸附在膜面上而形成的。随时间的延长，由于浓差极化及膜孔堵塞等原因，透液通量值变化缓慢，可见堵塞发生在超滤的最初阶段。 
2.1.3过滤压差 
操作温度为20℃，膜通量为超滤后5分钟的平均值。 
 
图3 过滤压差与膜通量的关系 
 
从图3可见，在小于0.12MPa范围内，随着过滤压差的增大膜通量随之增大；而在大于0.12MPa的压差下，随过滤压差的增大膜通量的变化趋于平缓。 
2.1.4 膜截留分子量(MWCO) 
表1 
MWCO( kDa) 50 100 150 
截留率（％） 100 97.3 94.4 
膜通量（L/m2.h） 54 86 101 
 
2.2超滤结果分析 
测定截留液中蛋白质浓度，计算其回收率。 
 
表2 超滤结果分析 
抗体浓度（mg/mL） 总蛋白浓度（mg/mL）抗体纯度（％） 抗体回收率（％） 
2.37 2.95 86 91.89 
 
2.3 DEAE离子交换层析柱进一步纯化抗体 
由于所分离的抗体等电点是5.2，所以选用阴离子交换层析进一步纯化。超滤截留液经DEAE离子交换层析相进一步纯化后，纯度可达86％。 
由图中可以看出，抗体只有一个主峰。经过纯化的IgY毛细管电泳见图4。 

 

图4 IgY毛细管电泳分离图 
Fig 4 IgY capillary electrophoresis separating 
 2.4 IgY超滤提取工艺的优化 
根据实验的条件及考滤在以后工业化生产中的实际情况，在本研究中，我们选用全因子试验对超滤的条件进行了研究 
2.4.1 因素水平的选择及实验设计 
综合2.1单因素影响实验结果，选择MWCO、进料温度、超滤时间和过滤压差为因素，以膜通量为响应值，各因子编码值及实验设计见表3及表4. 
表3 全因子试验设计因子编码及水平 
Table3-2 List of coded factors and levels for full factorial design.  
因     素 水平 Y 
-1 0 1  
Χ1(MWCO/kDa) 50 100 150 膜通量/ L/m2.h 
Χ2(过滤压差/MPa) 0.02 0.12 0.22  
Χ3(超滤时间/min) 0 30 60  
Χ4(进料温度/℃) 10 30 50  
 
 
表4 分析方案及实验结果 
Table4 Program and experimental results 
序号 Χ1 Χ2 Χ3 Χ4 Y 序号 Χ1 Χ2 Χ3 Χ4 Y 
1 -1 -1 -1 -1 95 11 -1 1 -1 1 118 
2 1 -1 -1 -1 111 12 1 1 -1 1 134 
3 -1 1 -1 -1 114 13 -1 -1 1 1 80 
4 1 1 -1 -1 130 14 1 -1 1 1 96 
5 -1 -1 1 -1 76 15 -1 1 1 1 100 
6 1 -1 1 -1 92 16 1 1 1 1 115 
7 -1 1 1 -1 96 17 0 0 0 0 114 
8 1 1 1 -1 111 18 0 0 0 0 113 
9 -1 -1 -1 1 99 19 0 0 0 0 115 
10 1 -1 -1 1 115 20 0 0 0 0 112 
 
 
2.4.2 实验方案及结果 
实验方案及由此方案进行实验所得的结果见表4及表5。不难看出，Χ1，Χ2及Χ3膜通量有较为显著，而X4的影响不显著；另外，各因素之间交互作用均不显著。因此，结合单因素实验，我们可以得出，在截留分子量(MWCO)一定的条件下，超滤的最佳条件为过滤压差为0.12MPa，温度为30℃，在容许的范围内尽是减少过滤的时间，从而增加膜通量，提高工作效率。 
 表5 方差分析 
Table5 Variance analysis 

Source	DF	SS	MS	F	Pr > F
X1	1	992.25	992.25	38.87788	0.000152
X2	1	1482.25	1482.25	58.07684	0.0001
X3	1	1406.25	1406.25	55.09904	0.0001
X4	1	64	64	2.507619	0.147757
X1×X2	1	0.25	0.25	0.009795	0.92333
X1×X2	1	0.25	0.25	0.009795	0.92333
X1×X4	1	0	0	0	1
X2×X3	1	0.25	0.25	0.009795	0.92333
X2×X4	1	0	0	0	1
X3×X4	1	0	0	0	1
Model	10	394.55	394.55	15.45908	0.00017
Error	9	2229.7			25.52222
(Lack of fit)	6	24.7	37.45	22.47	0.013686
(Pure Error)	3	5			1.666667
Total	19				4175.2

3 讨论 
超滤是20世纪70年代兴起的一种新的膜分离技术，该技术成本及能耗低，操作条件温和，因此特别适用于生物活性物质的分离[4,5]。超滤是一种以膜两侧的压力差为推动力，超滤的工作温度在30～40℃，也可达50℃，其膜孔径范围一般为1.5～50nm，所用静压差一般为100～500kPa。超滤设备和工艺较其它分离方法简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用。超滤膜技术因具有分子级分离、无相变、无溶剂污染、不破坏生物活性及操作简便等特点，其应用越来越广泛[6～8]。尤其是在蛋白质和某些低相对分子质量的分离纯化方面的应用[9～12]。超滤技术还用于蛋白质的分级分离，这方面的报导也比较多[13]。马培松等进行了平板式膜分离免疫球蛋白的研究[14]；周柏林应用超滤技术分离血浆蛋白[15]。若想使两种蛋白质用超滤完全分离，其分子量差异必须达10倍以上。与色谱法比较，超滤分离精度不高，同时不能多组分的分离。故通常不用超滤进行蛋白质的精细分离。 
4 结论 
超滤其液体流动方向与其方向一致，随着超滤的进行，超滤膜表面形成的滤饼层厚度逐渐增大，流速逐渐降低。超滤操作条件：超滤膜分子截留量为50kDa，操作压力差0.12MPa，进料温度30℃。随着超滤时间的延长，膜就会出现污染现象，这时必须对膜进行清洗，以延长膜的使用寿命。 
 
参考文献 
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[15] 周柏林，超滤技术在血浆蛋白分离上的应用[J].生化药物杂志，1991，2：36～37