请教各位：用Pfu作PCR后由于没有A尾，现在我要进行加尾反应，如何进行啊？
我看见过一个说法：胶回收后，再加入Taq酶，72℃保温15min。
这种说法对吗？还有就是酶和回收后溶液的比例是多少啊？

PCR后不跑胶也可以啊，用回收柱回收，再加Taq酶(还要加dATP,25微升体系加2微升2.5mM dATP)，72度10-20min即可(我们这边习惯用30min)。
比例按照PCR反应的比例就可以了。

你可以先回收,这样可以减少很多杂带,但也会减少产量.你可以不用回收,直接用Taq酶PCR体系,加1ug左右PCR产物,72度反应20分钟,再跑胶纯化,这样一步回收,可以减少产物损失. 你也可以参考: file:///E:/R%26D/A-Tailing/Protocol%20Online%20Addition%20of%203'-A%20Overhangs%20(A-Tailing)%20to%20PCR%20Product.htm 希望获得成功.

fgm 版主 ,联接有问题哦.

1，不回收可以直接加Taq然后72度反映 2，如果纯化回收则最好在加A体系中采用dATP而不是dNTP。

谢谢各位的回应，我也是认为回收后再进行加尾的话，损失太大。如果我用Pfu和Taq的混合酶作PCR，你们说说最后会有A尾吗？

会有。很多高保真的但是产物带有A尾的Taq酶实际上就是pfu酶和普通酶的混合物，例如宝生物的LA Taq酶。

不过不知道大家有没有用过酶的混合液，以你们的经验多少的比例比较好呢？我曾经看过：Taq酶:pfu＝15：1效果不错，不知道大家的意见如何呢？

5:1到15:1都可以,混合酶效果和保真性都不错. to kaige88：那链接没有问题。我经常上那网站。

[quote user="fgm"]

to kaige88：那链接没有问题。我经常上那网站。[/quote]

 

你提供的是脱网浏览的网址，不是原始网址。