鼠源单克隆抗体的制备目前已是一个非常成熟的技术，但其周期长，对经验，技巧和实验条件有一定要求，因此要真正掌握该技术却不是一件容易的事。另外，如何有效得筛选到配对单抗以应用于生产更是很多人所关注的。本贴的目的就是希望大家能交流经验，互相促进。
    可以从以下几方面开展
   (1)你觉得单抗制备中最关键的哪些步骤？谈谈你的经验（包括成功的、失败的），为其它正在做单抗或即将要做的酷友们提供一些帮助。
   (2)单克隆抗体目前的市场状况，以及如何从实验室水平转入大规模生产？
   (3)非鼠源单抗（如兔源单抗）的制备方面。
   (4)目前做单抗遇到的问题，大家在这里帮忙分析解决。
    ………
   话题很广，只要言之有物，奖励从宽！

  
   
  

不错的话题 没做过单抗，希望做过的酷友积极参与讨论哈，我也跟着学一下

我在做单抗的时候跑电泳时候不加还原剂除杂质外应该出现几条带？ＭＡＲＫ是选择３９１３吗？ 煮沸的目的是什么？谢谢了

首先，你的单抗是来自腹水还是细胞培养上清？有没有纯化过？
纯的IgG，跑SDS-PAGE应该有两条带，大约在25KD和50KD处（IgG轻链25，重链50），据此选择合适的Marker。
电泳前煮沸是为了变性彻底。当然，也可以跑非变性电泳，这样跑出来就是一条带，分子量约150KD（IgG有两条重链、两条轻链），但非变性电泳条件复杂一些。

一凡，那请问加还原剂和煮沸的目的都是打开二硫键，他们都什么区别吗？如果我不想做还原的还用煮沸吗？ 我做的是纯化过的，一凡兄有ＱＱ吗　留个

刚才可能没说清楚。 首先，SDS-PAGE中，还原分子间二硫键的主要是巯基乙醇，也就是说，即便是没加热，但只要加了巯基乙醇或DTT等还原剂，蛋白分子间的二硫键还是会打开，跑得还是还原电泳。 加热的目的我想主要是使蛋白亚基充分暴露，有助于SDS和蛋白完全结合，最后蛋白都成了长椭圆形状，加上SDS带的负电荷很多，远远大于蛋白原来带的负电荷，使得电泳中蛋白的迁移率取决于其分子量（而与其形状、电荷无关）。所以我上面说非还原电泳比较复杂部分原因也在此，因为在非还原电泳中，蛋白的迁移率不仅与分子量有关，还与蛋白的三维形状、所带电荷有关。 你实验的目的是什么，如果仅仅是想鉴定纯化后单抗的纯度的话我觉得做变性的SDS-PAGE就可以了，看除了25KD和50KD的蛋白带外是否还有其它杂带就知道纯化效果。 还有一点，非变性胶有专门的marker，不能用SDS-PAGE的marker 我的QQ是120127690，尽量在论坛里讨论吧，这样大家都能参与进来，我的知识面也很有限，欢迎大家补充指正。

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这是我以前纯化的单抗腹水SDS-PAGE图，泳道1是marker，2是纯化前的腹水，3是硫酸铵沉淀后，4是protein A柱纯化后的，泳道4中，上面那条是重链（约50KD），下面那条是轻链（约25kd），希望对你有用

一凡实在感谢你的解答,很贴切,很细心,我加你QQ了,希望咱们有什么问题一起讨论,再次感谢!~

一凡我还想问个问题,我们制备了1年的单抗,纯化前是4mg/ml,纯化后就放-20C保存,一年以后在拿出来用双缩尿的方法测量蛋白,结果只有0.3个mg/ml.效价还没测量,我们老大说双缩尿已经不可行了,让我用lowry法在测一次蛋白,但是lowry法就可行吗?出现这种情况的原因是什么那?现在用什么方法比较可靠那?就算是效价失效了但是蛋白不应该跑掉啊,现在怎么做的蛋白一点颜色也没有,像是空白啊?一凡,一定帮忙啊!~

呵呵，不客气，大家一起讨论，共同学习。 （1）你说的单抗纯化前是用什么方法测定蛋白浓度的？4mg/ml是少了点，我以前制备的腹水纯化前测定浓度一般都在十几mg/ml以上，分别用考马斯亮蓝法和BCA法。 （2）纯化后你测过浓度吗（一年前）？抗体放-20度保存只要不反复冻融，基本上不会怎么损失的，是不是你纯化后本身浓度就是这么低的？你可以跑个SDS-PAGE检测一下啊，再做个Western或ELISA测定活性，毕竟抗体有没活性才是最重要的。 （3）不同的蛋白浓度测定方法有时候会相差很大的，一般来说，lowry法是比较权威的方法，生物或制药公司的GMP标准中都用lowry法测定，药典中也是。但Lowry法比较费时，且每步的时间都要相对严格，而BCA法相比而言省时，且两者精确度差不多，所以在一般实验室里我觉得用BCA法或考马斯亮蓝法就足够了。 （4）对于纯的IgG，我觉得最准备且方便的方法其实是紫外吸收法（OD280）。因为无论是Bradford还是BCA法，都需要标准曲线（一般用BSA），然而不同蛋白其氨基酸组成不一样，用BSA做标准是会有误差的（我做过试验，这个误差还不小）。所以还不如用紫外吸收法，1mg/ml的纯igG样品在OD280处吸光值是1.38（蛋白质技术手册，汪家政），这样用OD280/1.38计算出来的浓度反而会准确很多。如果想用Bradford或BCA来测的话，建议用纯的标准IgG做标准曲线，这样才会准些。 （5）当然，对于没有纯化过的抗体，像腹水，蛋白浓度测定就最好用BCA或Bradford，OD280误差很大。总之，不同方法的选择关键是看待测样品的属性以及缓冲溶液中是否包含存在干扰检测方法的因素。