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【求助】请教方法(关于感受态细胞)



【求助】请教方法(关于感受态细胞)

最近做试验需要高效感受态,不知哪位有比较好的方法,我把分子克隆上介绍的方法都试过了,好像很难达到10的八次方。谢谢。

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Re: 【求助】请教方法

我就用过最基本的CaCl2法,其他高效的没怎么接触过,我在网上找的,楼主细细参详,看看有启发没?呵呵

 

 关于感受态细胞(Competent cells)

 常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

 转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 
   

α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。

 

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

 

方法一:
  


细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。
  用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
  1.从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。
  2.在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。
  3.于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。
  4.倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
  5.以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上。
  6.于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。
  7.倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
  8.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。
  9.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。
  10.将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。
  11.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。
  12.每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
  13.将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。
  14.将平板置于室温至液体被吸收。
  15.倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。

 

方法二:
   

CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点:使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;转化效率略高于CaCl2法,一般可达106-108cfu/μg,满足一般实验需要;感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。

 

准备工作:
1. 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37度过夜至长
出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个,分别接种5ml LB培养基中,37℃,250rpm,
过夜培养。
2. 次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中(250ml 锥形瓶),37
℃,250rpm培养2小时,此时OD600约0.4—0.5。

 

感受态细胞的制备:

 

3. 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里,5000rpm离心5分钟,弃去上清。
4. 加入100μl预冷的Solution A,悬浮菌体,冰浴30分钟。
5. 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

 

细胞转化:

 

6. 在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA,混匀,冰浴30分钟,然后42℃ 1分钟热
击,再次冰浴2 分钟。加入0.9ml LB 培养基,20μl Solution B,37℃,振荡
培养1小时。
7. 取适当菌液(100-200μl)涂布相应抗性的平板。
8. 过夜培养约16个小时,数菌落数,计算转化率。

 

补充说明:

 

1. 所用器具一定要清洁;
2. 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的,建议装量不要高于此值:500ml 锥形
瓶装100ml培养基,250ml锥形瓶装50ml培养基;
3. 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ,效果会更好一些;
4. 为保证细胞处于对数生长期,培养后的菌体的OD值不要高于0.6;
5. 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作;
6. 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击,冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作
步骤,但转化效率低于热击方法,适用于对转化率要求不高的实验。

 

方法三:

 

1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜
2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3h至OD600=0.3
3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中,冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm离心5min,去上清液
5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中,置冰上30min
6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液
7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中,冰浴放置4-12hr备用。

 

方法四:
 


(1)将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TG1、TM101)接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡,通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2~0.5(5×107cells/ml),需2~4h。
(2)将培养物放于冰上致冷10min,于4℃离心细菌培养物,10000rpm离心10min。
(3)弃除上清,将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50ml)的50mMCaCl2和10mm Tris•HCl(pH8.0)无菌冷冻液体中。
(4)将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。
(5)弃上清,悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris•HCl(pH8.0)无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞,即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中,贮存于-80℃冰箱中。

 

 

方法五:TSB法(也是本人热衷的方法)

 

1.药品制备
1M Mg2+ (1M MgSO4 和 1M MgCl2等体积混合),用0.22um滤膜超滤除菌。
TSB液(30mL/ 80mL菌液)(现配现用):

PEG3350   3g
Tryptone 0.3g
Yeast extract 0.15g
NaCl 0.3g

以上 1210C, 15min 灭菌后,加入1M Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL

2. 步骤:
(1)活化菌株
(2)挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中
(3)取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养
(4)370C培养3-4小时,OD600在0.4-0.6
(5)离心,去上清
(6)加入20mLTSB,重悬
(7)离心,去上清
(8)加入10mLTSB,再加入15-20%的甘油,分装保存
注,整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。

转化程序


1)取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化,并立即放于冰上,加入DNA或连接反应混合物,DNA量通常≤50mg。用手指弹打试管10次,使之混匀,然后放在冰上40~45min。
(2)将管放于42℃水浴中2min。
(3)然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基,倒置混匀,并于37℃培养8~12h,干浴或水浴,不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
(4)每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素,并含有X-gal(20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)。
(5)铺板使细菌混合物干后,倒转平板放于30~37℃培养箱中18~22h。克隆在此期间应该出现,否则转化不成功。
常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外,还有很多。各种方法都各有其优缺点,我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。以期获得最高的转化效率。

 

 

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Re: 【求助】请教方法

木马还魂 ,好!奖!

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Re: 【求助】请教方法

谢谢。

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Re: 【求助】请教方法

fgm,你试了吗? 如果化学法制备感受态效果不是很好的话,不妨用电转化,其效率要高得过。 只是不知道贵实验室有无该设备。

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武林三国

Re: 【求助】请教方法

电转设备是有,但我们必须要使用化学感受态,情况比较特殊。

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Re: 【求助】请教方法

实际操作步骤: 1、从37℃培养过夜的平板中挑取一个菌落,转到5mlLB培养基中,37℃剧烈振荡培养5h。 2、将细菌转移至100ml一次性使用的预冷的离心管中,冰浴10min。 3、4℃离心4000r/min,离心10min。 4、弃上清,吸干培养液。 5、用预冷的0.1M的CaCl2重悬每份细胞沉淀。(每50ml初始培养物用30ml预冷的0.1M CaCl2 )。 6、4℃离心,4000 r/min,10min。 7、弃上清,吸尽残余培养液。 8、用2ml 0.1M CaCl2重悬每份细胞沉淀(每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1 CaCl2重悬)。 9、可直接用新鲜制备的感受态细胞做转化实验,也可将细胞冻存于-70℃。 冻存感受态细胞: 1、每4ml重悬细胞液加140μlDMSO,轻轻旋转混匀,将悬液置冰上15min。 2、每份细胞悬液再加140μlDMSO,轻轻混匀,置冰上15min。 3、迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管,封紧管口,没入液氮迅速冰冻,然后于-70℃贮存。 4、需要时,从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞,于手心融化后即移至冰浴中,放置10min,以下步骤见转化。 偶按照这个方法做出来的感受态感觉还可以,不过没有计算过效率。每次连接产物都能做出来。 有点体会是:不要让感受态细菌的浓度太低,高点比较好。有时候不一定按照里面所说的溶液的体积,最好根据每次收取的细菌的量,酌情加液。

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武林三国

Re: 【求助】请教方法

电转化在酵母中用的比较多吧

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Re: 【求助】请教方法

电转化在酵母中用的比较多吧,谢谢奖励

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Re: 【求助】请教方法

电转化多数系统都可以用,效率比化学法高,不过一般要摸索下条件,方案不通用

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