大家好！我又遇到新的问题了。
     我做PCR的时候，以细胞裂解液为模板，结果扩出来的片段很小，测序发现只有上游引物，没有下游引物，本来目的片段有1500bp（只扩出336bp目的片段）。我检查下游引物没发现有问题。
     各位帮忙想想为什么会出现这种现象？我是怀疑模板结构复杂，因为GC含量比较高。那如果真是这样，该怎么处理模板？谢谢！

不知道你的引物中的GC含量具体多高？引物的具体长度是？一般可以适当提高退火的温度。另外就是可以在PCR体系中加入DMSO，据说这个东西在扩增启动子的PCR体系中还是比较常用的。具体的浓度您可以到网上再查一下。 祝好运。

如yoursosufo 所讲,最好给出你PCR的具体程序和体系等详细内容,这样有助于具体分析.

我也被这个问题所困惑。

退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 1 甘油（5％-10％），甲酰胺（1％-5％）或者DMSO（2％-10％）可以加到高GC含量DNA模板的PCR反应（这些试剂改变了引物模板配对反应的Tm和聚合酶的热稳定性）。 2 三甲铵乙内酯（0.5-2M）也有助于高GC含量和长DNA的PCR反应。进行滴定以确定最佳浓度。使用三甲铵乙内酯时，降低熔解温度（92-93℃）和退火温度（低1-2℃）。 3 BSA(高达0.8μg/μl)也可以提高PCR反应的效率。

谢谢大家，我的模板长为1600bp，模板GC含量71％；上、下游引物为28bp，PCR体系扩其它片段没问题的。

[quote user="恬恬"]谢谢大家，我的模板长为1600bp，模板GC含量71％；上、下游引物为28bp，PCR体系扩其它片段没问题的。[/quote]

ＧＣ含量有点高，可以尝试ＬＡＴＡＱ酶中有一种扩ＧＣ含量高片段ＢＵＦＦＥＲ，实际加了ＤＭＳＯ等物质。另外，建议提取ＤＮＡ纯物质，可能其他代谢物干扰导致ＰＣＲ问题。

欢迎大家讨论，特设定为精华贴！回答好奖励威望！同时希望恬恬超管能反映该实验的进展情况，以促进大家判断分析问题的能力！

可以试试1M甜菜碱，5％DMSO，这些都有利于模板的解链，便于扩增。

谢谢大家的指导和版主的关心，我后来在体系中加了1％DMSO，同时改变了退火温度，分别由原来的55°，提高到58°和60°，结果还是只扩出来一条300多bp左右的片段，上游引物是正确褡裢，下游在300多bp的位置大概只有85％的碱基褡裢吧，而在1500bp的位置是100％褡裢，怎么就扩不出1500bp的片段呢？准备去买点甜菜碱试试fgm说的方法。