引自DXY:

 

    近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。

  

   SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的。DNA片段扩增出来。

 

 SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。

invitrogen公司5’RACE的方法为寡核苷酸帽法(Oligo caping method)，该方法由日本东京大学铃木等开发。其特点为大规模、高通量、高精确度。 1. 传统的cDNA克隆化技术的缺点：理想的克隆cDNA应包含模板mRNA的5'帽的结构以及3'多聚A尾的全长序列。 然而，传统的方法克隆的cDNA，多数情况下其5'末端为部分缺失状态。究其原因有二：一是在以mRNA模板进行逆转录过程中，逆转录酶在从模板mRNA中逆转录酶脱落，只能得到部分拷贝的cDNA产物；二是在进行逆转录过程中，用了部分5'末端被降解的mRNA为模板合成cDNA，因此在构建cDNA文库中得到的多数是5'末端部分缺失状态的cDNA。换言之，在构建cDNA文库的过程中，应用逆转录酶以及应用极易受降解的mRNA是不可避免的，因此5'末端部分缺失就不足为奇了。 2.全長cDNA的克隆：为了构建含全長的cDNA 文库，就有必要从含有多数为非全长的cDNA文库中挑选出全長cDNA的一个过程。如果我们有办法识别全長cDNA的5'端和3'端，就有可能挑选出全长cDNA。 mRNA的3'端中有一个多聚 A尾结构可作为明确的识别标记。事实上、传统的cDNA文库的构建过程，也正是利用了 mRNA 3'端这一特征性的标签（tag），用多聚T引物合成cDNA的第一链而构建的。在mRNA的5'端存在一个帽结构，而自然状态下的这一结构不能象3'端的多聚 A尾一样，直接作为一个识别标记。由此可以设想，把这一结构用某种序列来替换，使其变成一个象多聚 A尾一样的特征性的序列标签（sequence tag），就有可能作为一个识别标记，这就是寡核苷酸帽法作为 5'端的识别标记的思路。 3. 全長cDNA文库的构建：为了克服传统的方法构建cDNA文库中所存在的缺点，铃木等开发了用特征性的序列标签替换mRNA5'端的帽的新方法—寡核苷酸帽法(Oligo caping method)。这一方法所获得的mRNA 5'端有RNA寡核苷，3'端有多聚 A尾特征性，因此其两端均有特征性的序列标签作为识别标记，我们就可能构建只含有全长cDNA的文库。 4．本技术的意义：确定启动子区域精确的确定基因的转录起始位点。基因的启动子区域中含有许多重要的调控基因转录的DNA序列（顺式元件），若要阐明基因在转录水平上的调控机制，克隆启动子序列是必不可缺的关键一环。到目前为止，已阐明启动子序列以及它们的调控机制的基因数量非常有限。事实上，标准的真核生物有关的启动子数据库Eukaryotic Promoter Database中登录的基因启动子也不过数百个而已。这其中一个重要原因之一是许多基因未能确切的确定转录起始位点。S1核酸酶作图法、引物延伸法、5'RACE法等传统的转录位点的确定方法，技術要求比较高，且有时由于种种原因，难以确定确切的转录起始位点。而利用铃木等开发的寡核苷酸帽法构建的cDNA文库中，随机的克隆全長的cDNA，适合于大规模、精确的获得基因转录起始位点的信息。

RACE的另一种代表方法——Self-Ligation法 步骤： 1. 反转录（RT）反应。 2. Hybrid RNA的分解。 3. 单链cDNA的自身连接。 4. PCR扩增5’未知区域。 5. 目的DNA片段的切胶回收。 6. DNA序列测定。 引自DXY

各位战友用过其他的ＲＡＣＥ试剂盒吗？将其中原理讲出来吧，加分从优！

难道ＲＡＣＥ试剂盒类型就这些吗?

我没做过这方面 呵呵，不太了解

好也，谢谢了，最近正在做呢

thanks a lot

我5’和3’端序列都不知道呢，也可以吗？谢谢各位仁兄了。。。

thanks!