我用的是EcoRI和KpnI双酶切，质粒加了5ul，水浴锅可能稍有不准，切了大约9个小时，不知道酶切你们一般切多久啊？切下的剩余载体是我想要的。可是老有弥散现象，是我的质粒加多了还是切的时间长了？
下图是我的酶切图，其中PCM是我想要的载体，大约1万多bp，在最上面，谢了

1，你所有的条带都有拖尾和程度不同的弥散，似乎SPH的弥散程度最小。检查一下你质粒溶解的水的质量和电泳条件。 2，酶切的时间长短均可，从30min到过夜都可以。

1、您所提取的质粒的质量，这个最好事先要验证一下。（跟这些酶切的DNA一起跑个电泳对照一下就是了） 2、不知道您的5微升质粒是在多大的体系中进行酶切的，10微升吗？ 3、如果做胶回收的话，5微升的质粒是不是有点少？（具体的您可以根据您的DNA的浓度，以及常规的连接体系中所需大片段DNA的物质的量和其分子量进行计算，我说的麻烦，但是算起来并不是很麻烦的。） 4、 有时候弥散并不影响回收的结果，您可以适当延长电泳的时间，然后尽可能回收比较集中的区域的DNA片段，以防万一，您可以在胶回收之后再取部分的回收产物进行电泳，看看具体效果——这个时候如果还是弥散，那就有问题了，但是我做了几次，都还好——也就是说胶回收之前条带也是弥散的，但是回收产物进行电泳就好了。还有，我一般习惯将将要进行连接的大片段DNA和小片段DNA同时进行电泳，然后根据其亮度和片段的大小，粗略估计其物质的量浓度，然后在连接体系中尽量保证大小片段有合适的物质的量的比例。 一点拙见。还请多批评指正。 祝好运。

我用的是20ul体系的，质粒的量我是试着加的，您看这种现象我是要多加些呢，还是少加呢，非常感谢版主的解答和建议。质粒跑电泳PCM有两条带，亮度还可以，VAMP，sph都有三条带，亮度也行，是不是缩短酶切时间呢，我都是过夜切，我提的质粒不怎么好，是不是减少梅切时间？

如果质粒的质量不好，建议缩短时间，一般0.5-4hr均可。我一般是中午酶切，午觉回来电泳：）。 如果你电泳加样为5ul的话，感觉你的质粒浓度还是蛮高的。可以适当降低你酶切体系的质粒量。

这么多高手！ 嘿嘿

太牛了！高手就是不一样