荧光免疫测定
一．时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理 时间分辨荧光免疫测定 (time-resolved fluorescence immunoassay, TR-FIA)是以镧系元素螯合剂标记抗原或抗体，利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长相同的荧光分开的近代荧光光谱技术。
TR-FIA中使用的镧系元素有铕（Eu3+）、钐(Sm3+)、铽 (Tb3+)、铌(Nd)、镧(Dy)等，其中以Eu3+最为常用。镧系的三价阳离子不能直接与蛋白质结合，因此要用特殊的螯合剂将Eu3+等与蛋白质偶联，以获得稳定的Eu3+等标记的抗体或抗原结合物。常用的螯合剂有异硫氰酸-苯基-EDTA、1-（P-苯偶氮）-EDTA、二乙烯三胺五醋酸(DTPA)等。
由于镧系元素与抗原（或抗体）络合后，在激发光作用下，能量转移较差，发出的荧光很弱，因此，在测量时需加入荧光增强剂(β-，使复合物中稀土离子解离出来，再与增强液中β-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生很强的荧光信号，荧光增强达上百万倍，大大有利于荧光测量。
（二）技术类型
1．固相双位点夹心法 标准品或待测物先与固相抗体反应，洗涤后再加入Eu3+标记抗体，再次温育，生成Eu3+标记抗体-抗原-固相抗体复合物，充分洗涤后加入增强液，测定荧光强度，所测得荧光强度与待测物的浓度呈正比。
2．固相抗原竞争法 将大分子抗原直接或半抗原通过化学偶联法制成半抗原-蛋白质结合物包被在固相上，成为固相抗原，固相抗原和样本中的待测抗原共同竞争有限量的Eu3+标记抗体，样本中待测抗原浓度越高，则Eu3+标记抗体结合到固相上的量越少，故待测抗原浓度和荧光强度呈反比。
3．固相抗体竞争法 待测标本中抗原和Eu3+标记的抗原与固相抗体(特异性抗体包被固体)发生竞争性结合, 温育和洗涤后,把游离Eu3+标记抗原和Eu3+标记抗原抗体复合物分开,然后在固相中加入荧光增强剂,测定Eu3+标记抗原抗体复合物的荧光强度。荧光强度与待测抗原含量成反比，标准曲线与RIA曲线相似。目前为了生产试剂盒的方便，常用抗抗体（Ab2）包被固相，这种固体的抗抗体实际上是一种通用的分离剂，分离Eu3+标记抗原和Eu3+标记抗原抗体复合物。
（三）技术要点
以双位点夹心法测AFP为例。以抗人AFP多克隆抗体包被聚苯乙烯微量滴定条或珠，加入不同浓度的AFP标准品和待测血清，加入缓冲液反应4～6h。洗涤后，加入生物素化抗人AFP单抗，振荡温育反应4～6h。洗涤后，加入Eu3+标记链亲和素，振荡反应1h。洗涤后，加入增强液，快速振荡15min，放置15min后在时间分辨荧光仪上测量，从编制程序直接得出待测血清中AFP浓度。
（四）方法学评价 与传统的荧光素比较，镧系元素螯合物的一个特点是具有较长的荧光寿命。如铕的荧光寿命为4.3×108ns（纳秒），而人血清蛋白的自然本底荧光约1～10ns，相差5个数量级。利用延缓荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧完全衰退后测定，所得信号完全是长寿命镧系元素螯合物的荧光（图13-4），这样能有效地消除非特异性本底荧光的干扰。另一个特点是激发光与荧光发射光的波长差别显著，其波长转变达270nm，这又十分有利于排除非特异性荧光干扰，提高荧光信号的测量特异性，且发射光谱陡峭，荧光强度高，灵敏度高（可达0.2～1ng/ml）。
本法所用的检测仪器为时间分辨荧光仪。与一般的荧光分光光度仪不同，时间分辨荧光仪采用脉冲光源（每秒闪烁1000次以上的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异荧光本底衰退后，再测定样品发出的长寿命镧系荧光。
TR-FIA在灵敏度、特异性和稳定性等方面都可与放射免疫测定法（RIA）相媲美。而其线性范围宽 (跨越4～5个数量级)、分析速度快，却远远超过RIA、常规免疫荧光技术、酶免疫测定技术。此外，标记物制备较简单，有效期长，无放射性污染，应用范围广，并且测定自动化程度高，因而成为很有推广价值的超微量物质免疫分析技术。
（五）临床应用 TR-FIA目前已有仪器和相应配套试剂盒供应，主要用于测定蛋白质、酶、肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素、药物、肿瘤标记物及病毒抗原等。
二．荧光偏振免疫测定
（一）基本原理
荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子大小呈反比的特点对荧光抗体进行检测的技术。
荧光偏振免疫测定技术(FPIA)是一种均相竞争荧光免疫分析法。荧光素(FITC)标记的小分子抗原和待测标本中小分子抗原与相应抗体发生竞争性结合反应，当荧光素标记的小分子抗原和相应抗体量恒定时，反应平衡时结合状态的荧光素标记小分子抗原量与待测标本中小分子抗原呈反比。经490nm激发光作用下，发射出的荧光经过偏振仪形成525～550nm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,通向偏振仪的光信号很弱；而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,偏振光信号比未结合时强得多。因此，待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度越强因此荧光偏振信号强。根据荧光偏振程度与抗原浓度呈反比的关系，以抗原浓度为横坐标，荧光偏振强度为纵坐标，绘制竞争结合抑制标准曲线。通过测定的偏振光强度大小，从标准曲线上就可精确地换算出样品中待测抗原的相应含量。 反应系统中，待测药物和定量荧光素标记的相应药物（小分子）与定量的特异性抗体（大分子）竞争结合。当待测药物浓度高时，经过竞争反应，大部分抗体被其结合，而荧光素标记的药物多呈游离的小分子状态。由于其分子小，在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振程度也较低。反之，如待测药物浓度低时，大部分荧光素标记的药物与抗体结合，形成大分子的标记抗原抗体复合物，此时检测到的荧光偏振程度也较高。
（二）技术要点
有现成配套的试剂盒供应，现以环孢素(CSA)测定为例。
1.标本预处理:取待检全血中加入溶解剂和蛋白沉淀剂,混匀后,离心，取上清。
2.抗原抗体反应：在反应管中分别加入一定量的预处理标本上清、荧光素标记的环孢素、抗环孢素单克隆抗体抗体以及反应缓冲液进行抗原抗体反应。
3．偏振荧光强度测定：抗原抗体反应开始时立即用荧光偏振免疫检测仪测定其空白偏振荧光强度（P1），反应结束时再测定其偏振荧光强度（P2）。根据待测标本的偏振荧光强度P（P2-P1），从标准曲线上直接计算出所测物质的含量。
（三）方法学评价 与其他免疫学分析方法相比，FPIA具有下述优点：①均相测定简便，易于快速、自动化进行；②荧光标记试剂稳定、有效期长，并使测定的标准化结果可靠；③可用空白校正除去标本内源性荧光干扰，可获得准确结果。FPIA通常不适合大分子物质的测定，与非均相荧光免疫分析方法相比，灵敏度稍低一些。为提高FPIA灵敏度，可将相对大量标本进行预处理以去除干扰成分。如测定血清地高辛之前，血清蛋白先进行沉淀处理可使检测限达到0.2ng/ml。
（四）临床应用 FPIA法常用于小分子物质（特别是药物浓度）的测定。目前已有数十种药物、激素等和常规生化项目可以用FPIA进行分析：①临床治疗性药物浓度测定：环孢素、卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥等。②毒品的检测：鸦片浓度测定等。③其他：酒精等。
