荧光免疫组化技术
一． 基质标本的制作
荧光免疫组化技术主要靠观察标本的荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位，因此标本的制作十分重要。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中。标本要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。
1．标本的类型 基质标本是指固定在玻片上用作抗原的组织、细胞和微生物等。用于荧光免疫组化技术的基质标本有以下几种：
（1）涂片和印片 血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，干燥固定后就可用于荧光抗体染色。脑脊液、脏器（肝、脾、淋巴结等）、细菌菌落或尸体病变组织可把切面压印于玻片上作成印片，经固定后再染色。
（2）组织切片 这是组织学和细胞学最常用的显微镜标本片。主要有以下两种：①冷冻切片：为了使抗原最大量的保存，首选的制片方法是冷冻切片，其优点是操作简单，组织的抗原性保存好，自发荧光较少，特异荧光强，同时适用于不稳定的抗原，缺点是组织结构欠清晰。②石蜡切片：石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织结构的理想方法，而且可进行回顾性研究。其优点是组织细胞的精细结构显现清楚，但对抗原的保存量不如冷冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理。
（3）细胞培养标本 用HEP-2细胞或Hela细胞培养，待细胞在玻片上形成单层，固定后用作抗核抗体等检测的抗原片。还可使细胞单层生长在玻片上，再用病毒或病人标本感染，然后固定，用荧光抗体染色法检测病毒。
（4）活细胞染色 检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体等，均可用活细胞荧光抗体染色法。当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时，可用双标记法进行染色。
2．标本的固定 标本固定的作用不仅使细胞内蛋白质凝固，终止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，以保持细胞固有形态和结构，更重要的作用是保存组织细胞的抗原性，防止标本从玻片上脱落，除去妨碍抗体结合的类脂，易于保存。固定标本的原则应不损伤细胞的形态、细胞内的抗原和细胞膜的通透性。
蛋白质类抗原如血清蛋白质和抗体，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，则可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10% 福而马林固定或以微火加热固定。如有粘液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去。类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
3．标本的保存 标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置4℃以下保存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存一个月以上。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。
二．荧光抗体染色
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用
25～37℃ 30min，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。用PBS 充分洗涤干燥。
三．荧光显微镜检查
荧光显微镜是荧光免疫组化技术的基本工具，荧光显微镜与普通显微镜的不同之处在于光源、滤光片、聚光器及镜头等。
1．光源 由于荧光物质的量子效率极低，要有一个很强的激发光源，通常用高压汞灯、氙灯或卤素灯做为激发光源。
2．滤光片 滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。隔热滤光片安装在灯室的聚光镜前面，能阻断红外线的通过而隔热。在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种，其中紫外光滤片（UG）只透过波长275～400nm的紫外光，最大透光度在365nm；蓝紫外光滤片 (BG) 只透过波长325～500nm的蓝紫外光，最大透光度为410nm。靠近目镜的一组吸收滤光片的作用是滤除激发光，只允许荧光通过，透光范围为410～650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。观察FITC标志物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9。观察RB200标记物时，可选用BG12与OG5配合。
3．聚光器 聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。聚光器不应吸收紫外线，它与光源、光路、激发滤光片适宜组合，以期在黑色的背景上获得满意的荧光。
4．镜头 镜头需无荧光。目镜有消色差、氟及复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。
5．光路 光路分为透射光和落射光两种形式。透射光的照明光线从标本下方经过聚光器会聚后透过标本进入物镜，适于观察对光可透的标本。落射光的照明光线从标本上方经过套在物镜外周的特殊的垂直照明器，从物镜周围落射到标本上，经标本反射而进入物镜，适用于观察透明度不好的标本以及各种活性组织等。与透射光联合照明，可同时观察两种荧光素的荧光，或同时观察发荧光物质在细胞内的定位。
6．荧光强度判定 观察标本的特异性荧光强度一般用"+"号表示。"-"为无或仅见极微弱荧光；"+"为荧光较弱但清楚可见；"++"为荧光明亮；"+++"为耀眼的强荧光。临床上根据特异性荧光强度达"++"以上判定为阳性，而对照光应呈"-"或"±"。根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
7．荧光观察注意事项 荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。经荧光抗体染色的标本应在染色当天镜检，每次镜下观察时间以1～ 2h 为宜，时间过长将使高压汞灯的发光亮度下降，荧光减弱，工作人员观察过久对眼睛也有不良影响。作油镜检查时，必须用无自发荧光的镜油。
四．荧光免疫技术的类型
根据标记物和反应程序的不同，可将荧光免疫组化技术分类如下 :
1．直接法 用荧光素标记特异性抗体，将特异性荧光抗体直接滴加于待测标本上，直接与相应抗原反应。此法常用于细菌、病毒等病原微生物的快速检测和肾活检以及皮肤活检的免疫病理检查。本法操作简便、特异性高、非特异性荧光干扰因素少。缺点是敏感度偏低，而且每检查一种抗原需制备相应的特异性荧光抗体。
2．间接法 用荧光素标记抗球蛋白抗体（抗抗体），待基质标本中的抗原与相应抗体（第一抗体）反应，再用荧光素标记的抗抗体（第二抗体）结合第一抗体，通过荧光现象检查抗原或抗体。此法常用于检测各种自身抗体。本法的敏感性高于直接法，而且制备一种荧光抗体可用于检测多种抗原或抗体。缺点是参与的因素多，易出现非特异性荧光，试验方法较麻烦，操作时间也较长。
3．补体结合法 用荧光素标记抗补体抗体，待基质标本中的抗原与抗体反应后，加入补体，补体和抗原抗体复合物结合。再加入荧光素标记的抗补体抗体，通过荧光现象检查抗原或抗体。本法敏感度高，制备一种荧光抗体可检测多种抗原或抗体，并且适用于任何动物的抗原抗体系统。缺点是易出现非特异性荧光染色，并且每次试验都需要新鲜补体，操作复杂。
4．双标记法 用两种荧光素 (FITC和RB200) 分别标记不同抗体，对同一标本进行荧光染色，若有相应的两种抗原同时存在，可同时显示两种荧光（黄绿色和橘红色荧光）。方法与直接法相同。本法主要用于同时观察细胞表面两种抗原的分布与消长关系，区分末梢血或同一切片中T和B细胞等。
五．影响荧光抗体染色的各种因素
1．pH 荧光素在溶剂中基本上处于离子化状态，因此，溶剂中的氢离子浓度对荧光强度的影响是极大的。每一种荧光素都有自己合适的pH值，它保持荧光素分子与溶剂之间的电离平衡。pH的改变可以引起荧光素荧光光谱的改变，并可造成荧光强度的降低。
2．温度 一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响。因为，温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光素分子的动力增大，使荧光淬灭的可能性随之加大，这就使荧光素分子与其他分子之间的相互碰撞几率增加，因此，影响了荧光素的荧光强度。一般情况下，温度在20℃时，荧光素即开始表现温度淬灭作用。随温度升高，荧光淬灭作用就越强，可至荧光完全淬灭。温度在20℃以下，荧光素的荧光强度随温度的变化改变不明显，基本上保持恒量。因此，在适当的低温环境中进行荧光显微观察，可得到更好的效果。
3．荧光素的浓度 在溶液浓度较稀时，荧光强度随荧光素浓度增加而增加。当荧光素浓度增加到一定程度时，荧光强度达到最大。再继续增加浓度，荧光素发生的光可能被邻近的分子吸收，使荧光强度下降。
4．某些细胞固定剂对荧光素有明显影响，如甲醛固定的细胞比不固定的细胞荧光强度减弱50%左右。虽然醇类固定剂也有轻微的淬灭荧光作用，但其影响较小。
5．非特异性荧光染色 免疫荧光染色除特异性荧光之外，还出现一些与靶抗原-抗体反应无关的荧光，统称为非特异性荧光。非特异性荧光染色可由于某些抗原的自发荧光及交叉反应等多种因素产生。有些非特异性荧光染色可通过对照进行鉴别与排除，有些则要通过对抗原的纯化、抗体的提纯、提高荧光抗体结合物的比例等方面寻找原因逐项清除。
六．方法学评价
荧光免疫组化技术既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形
态，直观性强。该方法可用于组织学中抗原或抗体的定位，也可用于体液标本中抗原或抗体的
定量检测。对于新鲜或陈旧标本，或污染杂菌的标本，只要处理得当，都不影响其结果判定。
其主要缺点是荧光容易消退，难以制备永久性标本，非特异荧光的干扰常影响结果的判断。本
法的另一局限性是需要有荧光显微镜才能观察结果。
七．荧光抗体技术的应用
荧光免疫组化技术主要用于：
①血液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定。
②血清中自身抗体的检测（如抗核抗体、抗平滑肌抗、抗线粒体抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、抗胃壁细胞抗体及其他自身抗体。
③组织中免疫球蛋白和补体组分的检测。
④⑤特殊染色体的鉴定。
⑥激素和酶的局部组织定位。
⑦恶变组织中肿瘤特异性抗原的检鉴定。
⑧细菌和病毒的快速鉴定。
⑨寄生虫的检定与研究（如血吸虫、疟原虫等）。
