多聚集链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。

1  实时荧光定量PCR技术的方法学

1.1  原理  所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

    PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1.2  荧光化学  目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

    扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。

    扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

    直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标（molecular beacon）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor）。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET，此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。

1.3  定量方法  在real-time Q-PCR中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。

1.3.1 标准曲线的法的相对定量  由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）。

1.3.2  比较CT法的相对定量  比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。

1.3.3  标准曲线法的绝对定量  此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA和体外转入的RNA常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。

2  实时荧光定量PCR技术的应用

    Ｒeal-time Q-PCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性（SNPs）的测定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。

2.1  微小残留病变的检测　肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变（MRD）的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。Real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病（AML）最常见的染色体异常是交互易位t(8；21) (q 22；q22)，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用real-time Q-PCR来检测融合基因有助于对这些病人的MRD进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病（CML）的BCR-ABL融合基因；急性淋巴细胞性白血病（ALL）的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤（FL）的染色体易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-time Q-PCR的运用将不断地扩大。

2.2  细胞因子的表达分析  细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应（包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素（IL-1～IL-23），干扰素（IFN-α，IFN-γ等），集落刺激因子（CSF），肿瘤坏死因子（TNF），肿瘤生长因子（TGF-β等）和化学因子（MCP-1，MIP-1等）。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而real-time反转灵PCR（RT-PCR）以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。

2.3  肿瘤耐药基因表达的研究  对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞对耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有：ATP结合盒基因超家族（ATP-binding cassette superfamily）的膜转运蛋白介导的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白（P-gp），多药耐药相关蛋白（MRP），肺耐药相关蛋白（LRP），乳腺癌耐药蛋白（BCRP）等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶（Topo），谷胱甘肽（GSH）及谷胱甘肽-S-转移酶（GST），蛋白激酶C（PKC），脱氧胞嘧啶核苷激酶（deoxycytidine kinase）等，凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc等。多药耐药（MDR）是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time反转录PCR（RT-PCR）是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。

2.4  病毒感染的定量监测  扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。Real-time Q-PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较多的是在器官移值中对使用免疫抑制剂的病人用Real-time Q-PCR来定量测定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病人中用Real-time Q-PCR检测CMV感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗CMV药物治疗能使血中的病毒含量下降，Real-time Q-PCR对于快速定量骨移植病人的CMV感染和监测CMV复活是一个有用的工具。

3  存在的问题及应用前景

    在real-time Q-PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。另外，与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式（multiplex）检测的应用能力；（3）目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。

    随着技术不断改进和发展。目前real-time Q-PCR已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面real-time Q-PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及real-time Q-PCR技术的应用，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医生对疾病的诊断和治疗。

4  结  语

    Real-time Q-PCR的发展使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的手段去研究许多重要的基础课题。虽然此技术仍存在一些不足需要改进，但是它为real-time Q-PCR在常规诊断检测中的运用打下了良好的基础。Real-time Q-PCR将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。

实时荧光定量 PCR

Thomas D. Schmittgen Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, WA 99164.

对于从 90 年代初就开始接触定量 PCR 的实验人员来说，他们早已对繁琐的定量方法习以为常。早期定量 PCR 技术的难点主要在于：（ 1 ）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内（只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（ 2 ）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的 cDNA (1) 或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整 (2) ；有的研究者加一个竞争性模板 (3) ，有的做限制性的稀释梯度分析 (4) ，或者加一个 PCR 模拟（ mimic ）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增 (5) 。而扩增产 物的检测通常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。

对于已经开始使用实时定量 PCR 的研究者来说，过去的日子已经一去不复返了。在实时 PCR 中，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据。现在在 2 到 3 小时之内拿到数据已经不再是梦想。除此之外，实时 PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大大减少；可以进行多重 PCR 反应，而且不需要后期处理。

PCR 实时检测技术从诞生到现在已经有五年了，但是其应用在近两年才开始迅猛增长。在 Medline 数据库中，用" Taqman "或" real-time and PCR" 作为关键词搜索，在 1996 年有 19 篇文章，在 1997 年有 28 篇文章，在 1998 、 1999 、 2000 年文章数分别达到了 52 、 157 和 409 篇。在这篇文章写作的同时，在 2001 年已经可以找到 551 篇文章了。许多厂商也正在大力宣传实时荧光定量 PCR 仪及其相关的技术（包括软件、探针等），而且在不久的将来，会有更多的产品发布。针对实时定量 PCR 这一热点领域，我们收集了许多目前用实时定量 PCR 来定量 DNA 或 RNA 的方法，汇编成 9 篇文章，涵盖了从 mRNA 和病毒 DNA 定量到 DNA 的甲基化和单核甘酸多态性的扩增检测。

Giulietti 等人描述了通过实时 PCR 对 cytokine 基因表达进行定量的方法。因为这一类基因在免疫的诸多方面都起着非常重要的作用，读者会发现这篇文章非常有用，特别是文中列出了许多 cytokine 基因和看家基因的引物和探针序列。就象大多数方法一样，这篇文章描述的定量检测 cytokine 基因表达的方法可以外推检测许多不同种类的 mRNA 。同时这篇文章也对实时定量 PCR 做了一个很好的综述，包括探针的化学原理和仪器介绍。我们推荐这个领域的所有新手应该先读读这篇文章。

对于 DNA 或 RNA 的常规定量来说，有两种定量方法：绝对定量和相对定量。绝对定量检测模板数的精确拷贝数，通常要用到标准曲线。在 Niesters 的文章里讨论了绝对定量用于病毒载量分析的方法。而相对定量能给出样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。通常，给出基因表达的相对变化就足够说明问题了，并不需要给出绝对量的变化。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时。对于那些想得到相对表达数据的研究者来说， Livak 和 Schmittgen 文章中的公式对于数据分析是非常有用的。这篇文章描述了 2 - ΔΔ CT 方法的推倒 、假设和 2 - ΔΔ CT 在基因相对表达分析中的实际应用。文章中也讨论了 2 - ΔΔ CT 方法的两种衍生方法，以及数据分析的一些小窍门。包括表格设计等。 Lehmann and Kreipe 等人在他们的 文章中将 2 - ΔΔ CT 方法用于病人标本的定量研究。

cDNA 芯片和差异显示是两种最常用的高通量筛选基因表达差异的技术。这两种技术的缺点在于它们只是定性而非定量分析，因而需要用一个定量的方法确认基因表达的差异，而实时 PCR 就是非常合适的一种手段。 Rajeevan 等人的文章描述了一种利用 SYBR-Green I 通过实时 PCR 检测产物并进行熔解曲线分析的方法，并用该方法对 cDNA 芯片和差异显示 PCR 技术的结果进行了确认。将实时 PCR 和高通量方法的结果相互比较就能对这个基因是否真的存在表达差异进行确证。相对于 Taqman 探针而言， SYBR-Green I 更高的灵活性使其被用于高通量筛选出的基因的快速确证。

另一个实时 PCR 方法应用的例子是 DNA 甲基化的检测。 CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5’- 甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。 Laird 和他的合作者使用了一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异实时 PCR 技术。在扩增之前， DNA 经重硫酸纳处理，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样， Methylight 无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的 DNA 检测中被证明 （ 6 ） 。

实时 PCR 可以分辨点突变，已经被广泛应用于遗传分析。 Sevall 描述了一个直接用实时定量 PCR 区分等位基因的方法。有不同的荧光报告基团标记的 Taqman 探针分别与野生型和突变基因杂交。探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种则说明它是一个纯合子，如果两种荧光信号都增加则表明是一个杂合子。实时定量 PCR 的数据被标在 xy 坐标轴上来区分特异的基因型。利用这种方法，能在不到两个小时内很快对 96 个样本进行基因分型。

另一个核酸定量的重要应用领域是活体切片检查。世界各地的病理系都储存有大量的福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片。过去如何利用这些活体切片存在许多困难，包括抽提核酸（特别是 RNA ），在切片中分离特定组织（如癌症组织和正常组织）。正如 Lehmann 和 Kreipe 文章中所讨论的，激光显微切片技术结合实时 PCR 技术很大程度上提高了在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行常规分析的能力。文章讨论了各种实验室不同的固定条件对核酸扩增的影响。读者会从文中找到许多有用的实验方法：包括从固定液的组成，最佳的固定条件以及激光辅助显微解剖技术。同时文章也讨论了如何在福尔马林固定和石蜡包埋的活体切片中进行 DNA 甲基化分析的方法。

实时 PCR 不仅仅增强了我们进行常规定量分析的能力，也提高了我们高通量筛选的能力。一个明显的例证是实时 PCR 和分子信标的结合正在成为检测单核苷酸多态性的的新方法。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定的药物的不同反应有着重要的意义。 Mhlanga 和 Malmber 在文章中，对用分子信标实时检测 SNP 的技术和方法做了很好的综述。分子信标是双标记的荧光探针，由两个部分组成：一个环状区与目标序列完全配对，一个自身配对的茎区。在环区和目标序列配对之前，荧光被淬灭基团淬灭。一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变的简单而准确。引物或分子信标设计的方法和原则、反应条件、数据分析在文章中都有详细的讨论。文章中还包括了一个用分子信标检测雌激素受体的特异性等位基因的例子。

在同一反应中同时检测多种 PCR 产物（如多重 PCR ）已经有 10 年了。在传统的多重 PCR 反应中，不同的扩增产物通过在胶中不同的迁移速率进行检测 (7) 。 Wittwer 等人描述了实时多重 PCR 的方法和应用。这个实验是在一个快速循环的 PCR 仪的玻璃毛细管中进行的．它只采用了一个荧光探针，而不是两个荧光探针。多重 PCR 可以通过检测不同颜色或温度或者同时检测颜色和温度来区分。随着技术的进步，现在已经能在多重 PCR 反应中同时检测四种颜色。将温度和颜色组合，实时 PCR 可以检测每个反应中高达 12 个的产物。在这篇文章中，多重实时 PCR 被用在了等位基因检测和突变筛选中。

准确的对动植物或者是人中病毒感染的细胞进行定量无疑是很重要的。这个领域发展非常快，而实时 PCR 在其中扮演了一个很主要的角色。 Niesters 描述了用实时 PCR 定量病毒载量的方法。这篇文章也是讨论实时 PCR 是否能用于常规诊断的文章之一。在文章中给出了 DNA 和 RNA 病毒检测的方法步骤。在这篇文章中也讨论了所谓的 NASBA 技术（ nucleic acid sequence-based amplification ），它是一种等温的 RNA 扩增反应，初始 RNA 被扩增成与模板互补的 RNA ，而分子信标被用来检测这种 RNA ，这其中没有任何背景 DNA 的扩增。这种方法对反转录病毒的定量特别有用。文章还包括了关于标准曲线和准确性的讨论以及不同实验室在定量病毒载量时是否需要内标的讨论。

PCR 技术在 80 年代中期出现后，又有许多技术上的新发展。在实时 PCR 出现之前的所谓定量 PCR ，需要特别的训练、严格的测试和特别准确的加样。而实时 PCR 的出现使得科学家能用一个相对直接的方法研究许多基本而重要的问题。同时实时 PCR 作为常规诊断的手段虽然还有许多困难需要克服，但已经被确立。实时 PCR 在短时期内迅速崛起，它的诸多优点使得旧的实验方法被打入冷宫。虽然我们还会记起那些老的实验方案，但毫无疑问，它们以后再也用不上了。

参考文献

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实时荧光定量 PCR技术原理与应用

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。

图 1 实时荧光扩增曲线图

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。

图 2. 荧光定量标准曲线

CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 3 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

 

图 3 阈值线和 CT 值

荧光探针和荧光染料

实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

1．SYBR Green I

图 4 SYBR GREEN I 工作原理

SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

图 4. SYBR GREEN I 工作原理

SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响 1 。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。

2．分子信标（molecular beacon）

分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图 5 ）。

图 5. 分子信标工作原理

3．TaqMan 探针

TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

图 6. Taqman 探针工作原理

4. LUX Primers

LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图 7 ）。

图 7.LUX 引物工作原理

与 Taqman 探针和分子信标相比， LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为 LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。

实时荧光定量 PCR技术的应用

实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：

1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。

2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证

3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。

随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。
转自：bio168

楼主辛苦了，支持！

荧光定量PCR本身就不错，但需要银子。 估计实时一下，我就只能奢望了。

实时荧光定量PCR —一种科学准确的定量方法还是有很多要注意的细节的

具体是怎么计算原有的量的