PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。

 

SOE法

　　1989年，Horton等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension），即通 过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。

　　（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引 物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。

　　（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段A、B和C、D。

　　（3）两种产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对，成杂交链。

　　（4）在DNApolymeraseI作用下，A和D链互为引物和模板，合成出A'D'链，即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列，则在接接产物中，将按预先 设计要求出现定点突变。

 

SDL法

　　1991年下半年，Lebedenko等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：

　　（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸，产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关， 而是由切点附近的序列决定的。

　　（2）扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。

　　（3）唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右 侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。

　　（4）把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺 序依次拼接。

　　显而易见，在SOE法中，退火时的最希望产物是AD，杂交链，但A链和B链，C链和D链 配对的可能性更大，另外还有B、C链的配对，这些都是不利的；而SDL法中就不存在 这个问题。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在复制中可能带来的错 误，所以，SDL法更优越。   

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污 染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.

 

一、SSCP的原理及特点

　　日本Orita等研究发现，单链DN***段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DN***段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DN***段中未知位置的碱 基突变.Takao，经实验证明小于300bp的DN***段中的单碱基突变，90%可被SSCP发 现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DN***段.

 

二、SSCP的不断改进

　　SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.

　　为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂 交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用 探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.

 

三、PCR-SSCP的实验操作

　　在小于1Kb长度的情况下，DN***段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

DN***段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)

1Kb～700b 3.5

700b～500b 5

500b～200b 8

200b 12

　　在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

　　1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.

　　2)电泳

　　取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

　　3)银染法

　　将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.

 

四、SSCP的应用

　　自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测 了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比 较，发现在全长2.6kbp的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测 出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏 性.

　　SS