关于稳定转染真核细胞的鉴定（即外源基因在真核细胞的表达）——
                                                                   一些个人体会（原创）

引言：既然提倡原创，而且风也放出来了，那就赶紧实施吧，呵呵！

    以前的实验过程中，做过几次真核细胞的稳定转染。幸亏当时有高人指导，少走了不少弯路，印象很深。现在把自己的实验体会和大家分享一下，希望碰到类似问题的酷友们可以从中借鉴。夫才疏学浅，如有疏漏、寡闻之处，敬请拍砖。

    真核细胞稳定转染的实验周期较长，从构建载体、转染、筛选单克隆、扩大培养直到鉴定，加起来个把月的时间就扔进去了。而且更重要的是后续实验的延续性，只有对转染细胞的质量进行严格控制，才能满足实验的需要。因此，对转染细胞的鉴定是很慎重的问题，常用的方法有：

1. Western blot(蛋白水平，首选)

利用Western blot技术，对转染后细胞内是否有目的蛋白X的表达进行检测。这里，需要设置好阴性对照和阳性对照。举例说明：例如，我的载体里面有HIS-tag标记，那我就可以用HIS-tag抗体检测细胞中目的融合蛋白X－HIS的表达情况。当然，如果手里有针对目的蛋白X的抗体那就更方便了，直接用它就可以了。

阴性对照：稳定转染空载体的细胞的裂解液

阳性对照：表达X蛋白的细胞；或者体外表达X蛋白的大肠杆菌的菌体裂解液

在进行SDS-PAGE的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，然后转印、杂交、显影。最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照出现与目的蛋白X分子量相近的条带，且二者位置相当（当然，如果检测的是融合蛋白，则融合蛋白分子量＝目的蛋白X的分子量＋Tag的分子量）。

2. RT-PCR（mRNA水平）

通过RT-PCR检测目的基因X的转录情况。在进行扩增时要注意设置阴性对照和阳性对照。

阴性对照：RT反应时，将反转录酶用ddH2O代替，其余成分同实验管，同时进行反转录反应后，用PCR反应观察能否扩增得到目的片段。

阳性对照：以表达该目的基因X的细胞作为RT反应的RNA来源，同法进行RT-PCR；或者以含有目的基因片段的质粒DNA作为PCR模板，进行PCR反应。

在将PCR产物进行电泳的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照有相应大小的DNA片段出现，且二者位置相当。

但是，切记鉴定实验不是就此结束了，还有一个重要的实验：测序！！如果不经过测序的验证就直接下结论说细胞里有X基因的表达，未免有些武断。（个人的感觉是：RT-PCR的结果若不经测序验证，心中惴惴不已，何谈信心去做下一步实验。）

3. 其他

如原位杂交，免疫荧光，免疫细胞化学，活细胞GFP观察等则见仁见智，各位酷友可以在文献中search看看！

 

 

对于我这个处学者来说受益匪浅，谢谢楼主。我还想问一下怎样做稳定转染？

稳定转染

[quote user="padent"]对于我这个处学者来说受益匪浅，谢谢楼主。我还想问一下怎样做稳定转染？[/quote]

 

基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电穿孔等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验（即瞬时转染）。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆，这就是稳定转染。

稳定转染和瞬时转染的区别就是在转染后是否用药物筛选。

见基因转染（Gene transfection）技术介绍
http://www.genecool.com/bbs/6784/ShowPost.aspx

我常采用的方法是RT-PCR鉴定目的基因的mRNA，然后进行间接免疫荧光鉴定，最后是WB，一般经过这3步基本上可以明确稳定转染的成功与否。

此外还需注意几点：

1，采用RTPCR法鉴定的时候，最好用DNA酶处理一下提取的RNA然后再进行RT－PCR，以避免残留的质粒或其他污染。

2，采用WB的时候需要注意，如果表达水平一般不是很好，采用HRP-DAB或者HRP-TMB系统，其检测灵敏度在100pg以下，可能不能满足你用来检测真核细胞蛋白表达检测的需要，建议采用灵敏度更高的化学发光WB检测。

 

好贴，支持、鼓励原创！

 

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纤夫, 敬业!学习!

 

和Jack兄讨论一下：

[quote user="Jack"]
我觉得首先应该采用的方法是RT-PCR鉴定目的基因的mRNA，然后进行间接免疫荧光鉴定，最后是WB，一般经过这3步基本上可以明确稳定转染的成功与否。
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1.  其实从基因表达的过程来讲，是应该先鉴定mRNA，然后再做蛋白水平的表达（这里透露一下，其实我这个帖子以前的编排顺序是先RT-PCR，后WB，hehe）。但是对于真核细胞而言，基因发挥作用是依赖其表达的蛋白质，因此即使观察到目的基因的mRNA表达，也不能证明目的基因已经翻译生成了蛋白。所以最终证明转染成功即目的基因已经表达蛋白的实验是蛋白水平的Western blot。尤其在发表文章的时候多数都以Western blot的照片为证。

但对于从多个水平反复验证转染是否成功而言，Jack所言的RT-PCR/免疫荧光/WB也是很严谨的。

[quote user="Jack"]
此外还需注意几点：
1，采用RTPCR法鉴定的时候，最好用DNA酶处理一下提取的RNA然后再进行RT－PCR，以避免残留的质粒或其他污染。

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2.  Jack说的对，这一点很重要的，这样做可以排除DNA污染产生的假阳性。还有，我补充一点，在做RT-PCR鉴定的时候，可以做一个阴性对照，就是反转录的时候不加反转录酶，用水代替，这样可以检测是否有DNA污染。

 
[quote user="Jack"]
2，采用WB的时候需要注意，如果表达水平不是很好，采用普通的WB方法，例如普通的考马斯亮蓝染色可能灵敏度不够，建议采用灵敏度更高的银染和ECL发光检测法。
[/quote]

3.  这句话我没看懂，WB方法？？

 

最后，希望Jack以及其他酷友能够针对这个转染的问题多提意见，多多讨论，我这个抛砖引玉的目的也就达到了，谢谢先！

^_^，这里我犯了一个错误。普通的WB采用针对HRP的DAB底物，其灵敏度也就250pg左右，可能对于真核表达的检测力不从心。建议采用化学发光的WB检测试剂盒。目前国内公司例如康成和碧云天产的化学发光WBkit用起来还不错。如果有米还可以购买PIERCE的试剂。 已经修改了上面帖子的内容。

哦，原来如此。看来Jack的经验不少，我们实验室从一直用化学发光做Western blot，以前用过Phamacia的ECL kit，现在用Pierce的Super Sigal West Pico，效果还不错。对膜显色的做法没有经验。国产的化学发光WB kit没用过，不知道效果怎样。