在普通PCR引物里，大家一般认为计算GC含量和TM值不需要考虑5‘端的酶切位点和保护碱基， 但这个问题也是有争论的 ,因为理论上引物的附加序列在最开始的循环是不与模板结合的，而在后来的循环中是与模板结合了的。

我的问题是利用重叠pcr连接两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为：

F1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3

R1:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt 3’

F2:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3

R2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3


大家知道 R1   F2 包括3’端的引物区和5‘端的重叠区 可是对于基因A  B来说，重叠区序列在最初的循环中是不与模板结合的，属于附加序列，那么计算引物GC值和TM值时是否需要把重叠区序列考虑在内呢？我认为不考虑进去也是有道理的。如果考虑在内GC值TM值是否太高呀？有人把引物区和重叠区分开计算GC和TM ，请做过重叠pcr的酷友谈谈你们是怎么考虑的。谢谢。

问题也许弱了点，自己先顶下。

我觉得是需要考虑进去的。因为在第二个以后的循环中，附加序列就成为新的模板的一部分了。