我在扩增的时候,PCR产物比较弱,几乎看不到,麻烦各位给看看,拜托了,
扩增产物长度为824bp,扩增的是羊血基因组DNA(以前怀疑是DNA质量不好,换一些比较好的DNA效果也不是太好)
引物5'-TGTGTTTGTGGTGAGCCTGG-3’;
5'-ATGGAGAGGGTTTGCGTTTA-3’。
PCR扩增体系 25μL:
MgCL2（25mmol/L）
1.2 μL ,
10×PCR Buffer
2.5μL,
dNTP（2.5 mmol/L）2.0μL ,上游引物(5pm/L)
1.5μL ,下游引物(5pm/L)
1.5μL,Taq DNA聚合酶（10U/ul）0.5μL, 基因组DNA
2.0ul（50ng左右）57.1℃退火 30秒；72℃延伸 1分钟,33个循环其它参考文献的 MgCL2（25mmol/L）
1.5 μL ,酶2单位,退火62度1分钟,但是我按照这个方法扩增不出




[ 本帖最后由 xiliu 于 08-9-10 09:31 编辑 ]

目的片段多长啊？模板是什么？质量如何？根据你给的信息，很难分析原因。

引物不错，但是上面有两个条件，不知道LZ在问那一个，引物Tm只有58不到，62°是不行的

我想询问是让大家帮我分析一下原因,两个温度都扩不出,先谢谢了

我个人认为pcr扩增不出来主要可能是模板的问题。以前我也遇到过同样的问题，把各个实验条件都试过了，都没有出来结果。最后换的模板就出来了。PCR产物比较弱,几乎看不到就可能是模板的量的问题了，另外用基因组做模板的话，你最好看看有没有内含子，如果有的话就不能有基因组做模板了。

[ 本帖最后由 ziwen120717 于 08-9-10 10:07 编辑 ]

楼主可以不加MgCL2试试啊
你所用的KIT我平时用时并没有另外加MgCL2，
若实验不行，建议可以换换酶试试

提rna反转录可以试试