目前正要做融合蛋白的构建表达，我要融合的基因片段有3个，分别为A片段 1400bp ,B 片段 600bp
,C片段 550bp
拟这样连接A-Linker1-B-Linker2-C
构建好后连入pET载体。关于连接肽的问题
，我看了不少帖子，常用选glycine 做linker 因为它是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间不会影响两边蛋白的构象和功能发挥。linker链有几种形式，如 GSGGSG ,GSGGSGG GSGGSGGG, GGGGSGGG, G是甘氨酸，S是丝氨酸。我的问题是 linker1
linker2都设计为(G4S)3
这样设计是否可行呀？是不是两个linker最好区别开？ 我最近看老外的一篇文献他两个linker 分别为 EASPPGE , (G4S)3 。不懂！我到底应该如何设计呀？ 请各位大大不吝赐教啊，我是基因方面的新手。

帖子有点冷呀，我自己顶下。   顺便再问下连接3个片段的重叠pcr怎么做？特别是引物设计，两个片段的的重复pcr刚懂一点了，三片段呢？是不是先连两个，回收后再和第三个做重叠pcr呀？好像很复杂滴，引物设计难呀。

GSG编码序列内可以产生一个BamH I位点，可以酶切连接
一般这些LINKER没有什么很固定的形式，用G和S是因为G没有侧链，形成柔性连接，S常暴露在蛋白质折叠外部，与G配合也是一种柔性连接，目的都是为了不影响折叠而已。但是你也要注意，连续的G实际上是个疏水区，反而使蛋白质疏水性加大

谢谢 nano 斑竹的热心解答，你好酷哦！

关于重叠pcr你可以搜索看看，论坛里有相关的帖子。个人建议你先做后面的两个，再和前面的1400去连，感觉片段差别太大的话，做重叠pcr效果差一些。

哦，偶像纤夫斑竹来了，先谢谢您的指导，今天开学报道去了，才上论坛。重叠pcr我以前没做过，没底呀，师兄说也可以双酶切一个个的连，不过个人感觉那样太复杂了。以后在实验中遇到解决不了的问题，还望纤夫斑竹，nano斑竹等多多帮忙呀。

请问楼主，你最近试验做成功了吗？

我也是想表达2个不相干的基因，一个病毒基因1700，一个蛋白基因1900bp，但是对于连接肽 linker 的原理不是很懂，还请高人指点！！！
谢谢！！！

qq 187164611   请注 连接肽 谢谢！
mail: andyzzhaom@yahoo.com.cn

另外，我看到很多文献里用的linker都是(G4S)3这个， 是不是意味着他们添加的序列为：“GGGGSGGGGSGGGGS”呢？

[ 本帖最后由 andyzzhaom 于 08-10-16 19:50 编辑 ]